一种多重聚合酶链式反应方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种多重聚合酶链式反应方法及其应用，具体地所述多重聚合酶链式反应方法包括如下步骤：1)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系包含待扩增的模板、用于扩增的引物对、dNTP底物、聚合酶、用于进行聚合酶链式反应所需的试剂和PCR增强剂；2)对步骤1)的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应；和3)任选地，对步骤2)所得反应混合物进行电泳和/或测序检测，其中，所述的用于扩增的引物对包括3-30个引物对。本发明专利技术还公开了所述方法的应用。使用本发明专利技术方法可在极低的引物对浓度下实现对极低浓度模板(尤其是复杂模板)的高灵敏度高特异性扩增。

Multiplex polymerase chain reaction method and its application

The present invention relates to a multiplex polymerase chain reaction method and its application, specifically the polymerase chain reaction method comprises the following steps: 1) provide a polymerase chain reaction system, the reaction system containing amplified and used for amplification primers, dNTP polymerase, substrates, reagents for PCR and polymerase chain reaction the required strengthening agent; 2) to step 1) of the polymerase chain reaction polymerase chain reaction; and 3) optionally, to step 2) the reaction mixture was analyzed by electrophoresis and / or sequencing, among them, the used primers including 3-30 primer pairs. The invention also discloses the application of the method. By using the method of the invention, the high sensitivity and high specificity amplification of the extremely low concentration template (especially the complex template) can be realized under the extremely low primer concentration.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种多重聚合酶链式反应方法及其应用。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)能够在短时间内将特定的DNA片段进行快速富集，其原理是利用一对与模板DNA具有特异性相互作用的引物，在DNA聚合酶及四种dNTP等反应组分的作用下实现对某一特定DNA片段的大量复制。多重聚合酶链式反应(多重PCR)是利用多对特异性的引物在一个反应中对模板DNA的多个片段同时扩增。与常规PCR技术相比，多重PCR技术具有高效、省时、省样本等优势。因此，该技术在临床检测和基础研究中具有十分广泛的应用前景。但是，由于在多重PCR反应体系中存在多对引物，这些引物的最佳扩增条件各异，为得到能使所有引物对在同一反应条件下都达到较佳的扩增效率的反应条件，往往需要做大量摸索性的实验，包括改变反应体系、摸索合适的退火温度、引物设计等。此外，多重PCR反应体系中大量不同序列的引物以高浓度混合，引物之间也会发生相互干扰和竞争配对，这些相互作用会导致引物二聚体、引物与模板错配，进而导致非特异产物，而这会致使多重PCR失败。具体地讲，在PCR反应中，引物浓度至关重要。因此，在优化多重PCR的过程中，引物浓度是一个重要的调节参数。为保证扩增效率，通常在反应体系中加入远过量的引物，约5～25pmol，单引物浓度为100～500nm[引自分子克隆]。这些高浓度的引物容易引发引物二聚体或导致非特异扩增，而这些非特异产物在扩增过程中常常会与特异性产物竞争反应底物，从而导致一部分特异性产物的产量极低以致无法被检测到，造成假阴性。从引物相互作用的角度来分析，适当降低引物浓度能够降低非特异性扩增，但是，相应地所有产物的扩增效率也会随之降低。因此，多重PCR的发展和应用受到极大的限制。目前，解决这个问题的传统方法有：使用特殊的软件来设计多重PCR的引物(如MPprimer等)、优化反应组分和热循环条件(Markoulatos,P.,Siafakas,N.,
Moncany,M.Multiplex polymerase chain reaction:A practical approach.[J].Journal of Clinical Laboratory Analysis.,2002,16:47-51；Henegariu,O.,Heerema,N.A.,Dlouhy,S.R.,et al.Multiplex PCR:Critical parameters and step-by-step protocol[J].Biotechniques,1997,23:504-511)。传统方法主要依赖大量的条件摸索和经验的积累。除了基于经验的传统方法外，已有几种巧妙的策略来提高多重PCR的特异性。例如：利用复合引物(compositied primers)与巢式PCR相结合的策略也能较好的改善多重PCR的特异性和产量的问题(US2009/0253183A1、US 2010/0291668A1)。这一策略在引物设计时，将一段序列完全相同的引物加入到每一个特异性引物的5’端(通用序列)，从而组成复合引物。这一序列完全相同的引物称为通用引物(common primer)，它的序列与待扩增的模板不具有同源性。每一个复合引物由两部分组成：靠近5’端的通用引物和靠近3’的特异引物。在第一轮扩增中，复合引物中只有特异性序列能与模板配对并扩增，因此第一轮扩增能将各DNA目标片段扩增出来；此外，由于每个特异引物的末端都附加有一段通用引物的序列，因此在每一个扩增的产物的两端都具有相同的序列。在第二轮扩增中，只需加入一种序列(通用引物)即可完成所有目标产物的扩增。此外，在引物合成中加入非天然的人工碱基也能明显改善多重PCR的特异性。也有人报道称在多重PCR中引入一种单链结合蛋白RecA也能改善多重PCR的特异性。但是，上述方法均是针对某一特定反应体系进行的优化，在其它的反应体系中，如更换模板或改变待扩增基因，已有的优化方案往往是不适用的。此外，现有的优化方式往往需要进行多轮扩增且引物需要特殊设计，其时间成本和经济成本均非常高，无法满足多重PCR的实际应用。特别地，在实际应用中往往需要对一些低浓度的复杂模板(如人类基因组等)进行多重扩增，这就需要更大的工作量来摸索最优化方案。综上所述，本领域迫切需要开发一种新型的简单快捷且可以在低引物浓度下实现对低浓度模板(尤其是复杂模板)的高效精准扩增的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种新型的简单快捷且可以在低引物浓度下实现对低浓度模板(尤其是复杂模板)的高效精准扩增的方法。本专利技术的第一方面，提供了一种多重聚合酶链式反应方法，包括如下步骤：1)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系包含待扩增的模板、用于扩增的
引物对、dNTP底物、聚合酶、用于进行聚合酶链式反应所需的试剂和PCR增强剂，其中所述PCR增强剂选自下组：纳米金、纳米银、量子点、纳米多聚物、碳纳米管、石墨烯、或其组合；且所述聚合酶链式反应体系具有选自下组的一个或多个特征：a)所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为0.05-2pmol/25μL，且所述待扩增的模板选自下组：人类基因组模板、λ DNA、质粒；b)所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为2-25pmol/25μL，且所述待扩增的模板为人类基因组模板；2)对步骤1)的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和3)任选地，对步骤2)所得反应混合物进行电泳和/或测序检测；其中，所述聚合酶链式反应体系含有n个用于扩增的引物对，所述n为3-30的整数。在另一优选例中，所述人类基因组模板的浓度为2-200ng/25μL；和/或所述λ DNA的浓度为1000-1000000拷贝(copies)/25μL。在另一优选例中，所述人类基因组模板的浓度为3-160ng/25μL，较佳地为4-120ng/25μL，更佳地为5-80ng/25μL，最佳地为5-50ng/25μL。在另一优选例中，所述λ DNA的浓度为5000-800000拷贝/25μL，较佳地为10000-500000拷贝/25μL，更佳地为100000-300000拷贝/25μL。在另一优选例中，n＝4-25。在另一优选例中，所述n＝5-20，较佳地n＝6-15，更佳地n为6-10中任一整数。在另一优选例中，a)中所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为0.1-1.5pmol/25μL，较佳地为0.125-1.25pmol/25μL，更佳地为0.15-1.1pmol/25μL，最佳地为0.3-1pmol/25μL。在另一优选例中，b)中所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为2.5-20pmol/25μL，较佳地为3-15pmol/25μL，更佳地为4-10pmol/25μL，最佳地为5-8pmol/25μL。在另一优选例中，所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为10nM-400nM，较佳地为20nM-300nM，更佳地为25-200nm。在另一优选例中，所述各引物对中，上游引物和下游引物之比为约0.8-1.2：0.8-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系包含待扩增的模板、用于扩增的引物对、dNTP底物、聚合酶、用于进行聚合酶链式反应所需的试剂和PCR增强剂，其中所述PCR增强剂选自下组：纳米金、纳米银、量子点、纳米多聚物、碳纳米管、石墨烯、或其组合；且所述聚合酶链式反应体系具有选自下组的一个或多个特征：a)所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为0.05‑2pmol/25μL，且所述待扩增的模板选自下组：人类基因组模板、λDNA、质粒；b)所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为2‑25pmol/25μL，且所述待扩增的模板为人类基因组模板；2)对步骤1)的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和3)任选地，对步骤2)所得反应混合物进行电泳和/或测序检测；其中，所述聚合酶链式反应体系含有n个用于扩增的引物对，所述n为3‑30的整数。

【技术特征摘要】
1.一种多重聚合酶链式反应方法，其特征在于，包括如下步骤：1)提供一聚合酶链式反应体系，所述反应体系包含待扩增的模板、用于扩增的引物对、dNTP底物、聚合酶、用于进行聚合酶链式反应所需的试剂和PCR增强剂，其中所述PCR增强剂选自下组：纳米金、纳米银、量子点、纳米多聚物、碳纳米管、石墨烯、或其组合；且所述聚合酶链式反应体系具有选自下组的一个或多个特征：a)所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为0.05-2pmol/25μL，且所述待扩增的模板选自下组：人类基因组模板、λDNA、质粒；b)所述用于扩增的引物对的单引物终浓度为2-25pmol/25μL，且所述待扩增的模板为人类基因组模板；2)对步骤1)的聚合酶链式反应体系进行聚合酶链式反应，从而获得含扩增产物的反应混合物，其中扩增产物包括分别对应于所述引物对的各扩增产物；和3)任选地，对步骤2)所得反应混合物进行电泳和/或测序检测；其中，所述聚合酶链式反应体系含有n个用于扩增的引物对，所述n为3-30的整数。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人类基因组模板的浓度为2-200ng/25μL；和/或所述λDNA的浓度为1000-1000000拷贝/25μL。3.如权利要求1所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琛，张东华，张益，胡钧，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31