HIV-1早期感染相关的血清miRNA在制备试剂盒中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法在HIV-1感染早期检测中的应用。本发明专利技术涉及的miRNA分子包括hsa-miR-29a、hsa-miR-223、hsa-miR-27a、hsa-miR-19b、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-766、hsa-miR-30a-5p和hsa-miR-136*。用这9种血清miRNA作为分子靶标，建立了一种快速、敏感、特异的HIV-1感染早期的检测方法。本发明专利技术涉及上述9种miRNA在病毒感染早期诊断中的用法及检测这9种miRNA所用的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法及其人类免疫缺陷(HIV-1)病毒早期感染检测中的应用。
技术介绍
随着人们生活水平的不断提高，由人类免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起艾滋病(AIDS)由原来的吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散，疫情不仅严重地威胁我国人民健康，而且影响到经济发展和社会稳定。截止2011年底，我国存活艾滋病感染者和艾滋病人78万，每年新发HIV感染者4.8万人。早期发现和早期诊断艾滋病患者是减少传播机会、控制疫情的关键环节。目前的实验室检测包括HIV抗体、病毒载量、CD4+T淋巴细胞、P24抗原检测等。HIV抗体检测阳性虽然是HIV感染的金标准，但是一般抗体在感染病毒后4周才逐渐出现，患者从感染HIV到血清HIV抗体阳性反应的窗口期由于病毒的大量复制，具有较强的传染性；应用RT-PCR技术检测窗口期血液中的病毒核酸虽然具有很高的灵敏度，但是HIV病毒具有高度的变异性，随着抗病毒治疗的推广，病毒变异和耐药株不断出现，使检测的敏感性受到了限制；P24抗原检测能够在窗口期检测到抗原，但易出现假阳性；CD4淋巴细胞水平随着感染的发展而逐渐下降，一般用于病程监测。因此，寻找新的诊断技术，既要简便快速又要敏感、特异，是缩短窗口期，实现早期诊断，治疗、预测和监测疾病进程的迫切任务。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是约22个核苷酸长、单链、内源的非编码RNA，在转录后或翻译水平调节相关基因表达。最近研究表明血清miRNA不仅在肿瘤、心血管、代谢性等疾病，而且在病毒感染性疾病如肝炎的早期诊断中起着非常重要的作用，血清中成熟的miRNA分子具有高度的稳定性，而且在病毒血症消失后依然可以检测到。因此建立一种基于血清miRNA作为HIV感染的诊断标志物用于疾病的早期诊断及病程的监测具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种能够用于检测HIV-1病毒早期感染的新的血清miRNA标志物及其在制备制备HIV-1感染早期检测试剂盒中的应用。本专利技术的第二目的是提供一种HIV-1感染早期检测试剂盒及其使用方法。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种HIV-1早期感染相关的血清miRNA标志物，所述的miRNA标志物为包括如下9种：hsa-miR-29a(UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA)，其序列信息如SEDIDNO.1所示，hsa-miR-223(UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA)，其序列信息如SEDIDNO.2所示，hsa-miR-27a(UUCACAGUGGCUAAGUUCCGC)，其序列信息如SEDIDNO.3所示，hsa-miR-19b(UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA)，其序列信息如SEDIDNO.4所示，hsa-miR-151-3p(CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG)，其序列信息如SEDIDNO.5所，hsa-miR-28-5p(AAGGAGCUCACAGUCUAUUGAG)，其序列信息如SEDIDNO.6所示，hsa-miR-766(ACUCCAGCCCCACAGCCUCAGC)，其序列信息如SEDIDNO.7所示，hsa-miR-30a-5p(UGUAAACAUCCUCGACUGGAAG)，其序列信息如SEDIDNO.8所示，hsa-miR-136*(CAUCAUCGUCUCAAAUGAGUCU)，其序列信息如SEDIDNO.9所示。上述9种血清miRNA标志物筛选方法分为以下步骤：(一)低密度芯片用于检测患者血清miRNA的表达谱初步筛选，低密度芯片v3.0(TaqManLow-densityArray,TLDA)(AppliedBiosystems,CA)包含A和B两种阵列，共能检测754种人的miRNA。每块array都包含3种内参和一种阴参。ArrayA上主要检测的是比较被关注的miRNA，ArrayB上主要是近期被发现的miRNA。具体方法如下：(1)核酸提取：收集HIV-1感染早期病人血清10份，每份以30μL混合，健康正常人血清10份，每份以30μL混合，将两组血清(每组300ul)用试剂盒NucleoSpinmiRNAPlasmakit(Macherey-NagelGmbh&Co.KG,Germany)提取血清中的miRNA；(2)逆转录反应：提取的血清miRNA反转录采用TaqmanmiRNAReverseTranscriptionKit及RT引物均为ABI(AppliedBiosystems,CA，USA)公司提供；(3)预扩增反应：为了提高TLDA检测的灵敏性，逆转录后的cDNA需要加一步预扩增，其中预扩增引物MegaplexPreAmpprimer和试剂盒TaqManPreAmpMasterMix,2x由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(4)PCR反应：预扩增产物稀释后用于TLDA的PCR扩增，所用的试剂TaqManUniversalMasterMix,NoAmpEraseUNG和TLDA由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(5)数据分析：数据分析使用SDSRelativeQuantificationSoftwareversion2.3(AppliedBiosystems)。CT值(Thresholdcycle)大于等于40的为40(未检测出)。(二)根据以上表达谱结果进行分析，初步选出与正常人血清表达谱比较有显著差异的血清miRNA做为候选基因做进一步验证，在这里我们设定三个标准：(1)Ct值<35的检测值是认为比较可靠的；(2)患者血清miRNA与正常人血清miRNA相比的比值变化达到3倍以上；(3)与疾病相关的有生物学意义的候选miRNA。具体方法如下：(1)核酸提取：验证的miRNA提取每份样品用200μl血清，同时每份待测血清中加入25fmol的cel-miR-238做为内参，提取试剂盒和方法同上(低密度芯片部分miRNA提取)。(2)逆转录及PCR反应：qRT-PCR所用的RTstem-loop引物，TaqManmiRNA逆转录试剂盒(ReverseTranscriptionKit)，PCR引物和探针，TaqManUniversalPCRMasterMix(NoAmpEraseUNG)均由ABI(AppliedBiosystems,CA,USA)公司提供。(3)统计分析：对于荧光定量qRT-PCR所得到的Ct值用cel-miR-238的Ct值做本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HIV‑1早期感染相关的血清miRNA标志物，其特征在于，所述的miRNA标志物包括如下9种：hsa‑miR‑29a，其序列信息如SED ID NO.1所示，hsa‑miR‑223，其序列信息如SED ID NO.2所示，hsa‑miR‑27a，其序列信息如SED ID NO.3所示，hsa‑miR‑19b，其序列信息如SED ID NO.4所示，hsa‑miR‑151‑3p，其序列信息如SED ID NO.5所示，hsa‑miR‑28‑5p，其序列信息如SED ID NO.6所示，hsa‑miR‑766，其序列信息如SED ID NO.7所示，hsa‑miR‑30a‑5p，其序列信息如SED ID NO.8所示，hsa‑miR‑136*，其序列信息如SED ID NO.9所示。

【技术特征摘要】
1.一种HIV-1早期感染相关的血清miRNA标志物，其特征在于，所述的miRNA标志物包括
如下9种：
hsa-miR-29a，其序列信息如SEDIDNO.1所示，
hsa-miR-223，其序列信息如SEDIDNO.2所示，
hsa-miR-27a，其序列信息如SEDIDNO.3所示，
hsa-miR-19b，其序列信息如SEDIDNO.4所示，
hsa-miR-151-3p，其序列信息如SEDIDNO.5所示，
hsa-miR-28-5p，其序列信息如SEDIDNO.6所示，
hsa-miR-766，其序列信息如SEDIDNO.7所示，
hsa-miR-30a-5p，其序列信息如SEDIDNO.8所示，
hsa-miR-136*，其序列信息如SEDIDNO.9所示。
2.权利要求1所述的血清miRNA标志物在制备HIV-1感染早期检测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括以下组分：(1)RNA提取
试剂，以及cel-miR-238内参；(2)血清miRNA标志物的检测试剂，包括AMV反转录体系及反转
录引物、PCR反应体系及引物；(3)阴性对照，灭菌去离子水。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述cel-miR-238内参，是人工合成的外源
性的线虫的miRNA,其序列信息如SEDIDNO.10所示。
5.一种HIV-1感染早期检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1所述血
清miRNA标志物的检测试剂；所述的检测试剂包括AMV逆转录体系及反转录引物、PCR反应体
系及引物、阴性对照，灭菌去离子水。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括RNA提取试剂，以及
cel-miR-238内参是人工合成的外源性的线虫的miRNA,其序列信息如SEDIDNO.10所示。
7...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚宇华，胡海洋，郭宏雄，崔仑标，还锡萍，周明浩，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：江苏;32