从Grifola提取的抗肿瘤物质制造技术

通过提取和分级分离从ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ的菌丝体和子实体中提取得到了一种抗肿瘤物质，该物质具有潜在的免疫增强活性。菌丝体或子实体通过用热水提取并向提取物中加入终体积浓度为２０－７０％的醇类（低浓度添加）以除去悬浮物或沉淀物，可使所述提取物质的抗肿瘤活性和免疫增强活性提高。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利
本专利技术涉及具有高免疫增强活性的抗肿瘤物质，该物质是从“Maitake”蘑菇(Grifola)的菌丝体或子实体中提取并分级分离得到的。本专利技术技术背景已知从Grifola的菌丝体或子实体提取的由带有β-1,3-键连葡萄糖支链的β-1,6-键连葡萄糖主链构成的或由带有β-1,6-键连葡萄糖支链的β-1,3-键连葡萄糖主链构成的多糖具有抗癌活性(参见日本专利LOP公开No.210901/1984)。包括下列步骤制备抗癌物质也是已知的，所述步骤为用热水对Grifola frondosa,Grifola gigantea(Tonbimai)或Laetiporus sulphureus(Masutake)进行提取；减压浓缩提取液，用有机溶剂对浓缩液进行沉淀，对沉淀物进行透析以除去低分子量的物质，并用亲脂有机溶剂提取杂质以从透析液中除去它们。(参见日本专利公开No.16047/1968)。然而，日本专利LOP公开No.210901/1984和日本专利公开No.16047/1968中描述的那些方法，对于制备大量的药剂和从有限的资源来有效地制备健康食品而言不是很适合，因为这些方法的纯化步骤相当复杂，而且所得的产物中含有抑制免疫增强活性的物质。本专利技术的公开在此情况下，本专利技术人对提取Grifola的方法和由此方法所得的各种提取物进行了深入的研究。结果发现，有效地获得具有较高免疫增强活性的抗肿瘤物质是可能的。其主要特征在于，通过向对Grifola的菌丝体或子实体用水进行热提取而得的水溶性提取液中加入醇至体积终浓度为20-70％(低浓度添加)，来除去漂浮的物质或附着于容器壁上的物质，从而提高抗肿瘤活性和免疫增强活性。也就是说，本专利技术涉及具有免疫增强活性的葡聚糖/蛋白质复合物以及包含该复合物作为活性成分的抗肿瘤试剂，所述复合物由以下步骤制备而得(1)用水对Grifola的菌丝体或子实体进行热提取；(2)向所得的水溶性提取液中加入醇至终体积浓度为20-70％(低浓度添加)，使所述的提取液在容器中于1-25℃静置，并除去漂浮在液面上或液体中的物质或附着于容器壁上的物质；以及(3)向所述的提取液中加入醇至终体积浓度为80-90％(高浓度添加)，使所述提取液于1-25℃静置，并回收所得的沉淀，或在第(2)步之后，将所述的提取液浓缩以产生沉淀，或以通常的方式将所述提取液浓缩至干。在本专利技术中，“Maitake”蘑菇(Grifola)可以是Grifola frondosa,Grifola albicans Imaz.,Grifola umbellatus,Grifola gigantea等，而且这些蘑菇可以鲜蘑或干蘑的形式使用，如必要还可将它们切碎或使用其粉末的形式。所述的热提取在50-135℃进行15分钟-3小时。为快速提取，可在加压下于100℃进行该处理步骤，例如在约120℃，于2个大气压下，在高压罐中进行30分钟至1小时或1小时左右。所用的水是蒸馏水、纯化水、离子交换水、自来水等等。相对每重量份的干燥Grifola而言，采用约4-20倍(优选4-10倍)体积的水。如果采用的是新鲜的Grifola，对于每重量份的Grifola而言，采用约2-10倍(优选2-5倍)体积的水。在第(2)步，加入到提取液中的醇可为甲醇、乙醇等。向提取液中加入醇至终体积浓度为20-70％。可采用含水量为0-50％的醇类。在加入醇之后，于1-25℃静置1-20小时后，在液面上或液体中就会有漂浮物质出现，或者有物质附着于容器壁上，可通过过滤或用移液吸管、筛网等将这些物质除去。因为，将漂浮物质和附着于容器壁上的物质除去导致提取物的抗肿瘤活性和免疫增强活性的提高，除去所述物质的该步骤是极为重要的。对于该步，必须加入醇至终体积浓度为20-70％，优选至终浓度为30-60％。向第(2)步得到的溶液中加入醇至终体积浓度为80-99％，优选至终体积浓度为80-90％(高浓度添加)，然后使溶液在1-25℃，优选在1-5℃静置，以沉淀出所需的物质，或者，将第(2)步所得的溶液在加热下浓缩以产生沉淀，或将之浓缩至干。所得的本专利技术物质的特性如下外观棕色吸湿性粉末。溶解性溶于水，碱性溶液和二甲亚砜。颜色反应在蒽酮反应和水合茚三酮反应中为阳性。水溶液特性中性至弱酸性。分子量约1000000。对本专利技术所得物质的分析表明其主要成分是葡聚糖和蛋白质。经柱色谱纯化之后，发现本专利技术所得的具有免疫增强活性的抗肿瘤物质的主要成分是葡聚糖/蛋白质复合物，其中葡聚糖和蛋白质的比例主要在80∶20-99∶1之间变化，该比值取决于作为起始原料的Grifola的质量，以及提取和纯化的条件等等。实施本专利技术的最佳方式(1)提取方法在120℃下用5升蒸馏水对500干燥的Grifola frondosa的子实体提取60分钟，向所得的950ml水溶液部分中加入乙醇至终体积浓度为60％。当该溶液在4℃静置12小时后，在液面上、液体中或在容器壁上有棕黑色的粘性物质生成。用吸管除去这些物质。在加入乙醇至终体积浓度至至少80％之后，使溶液在4℃的低温下静置，得到3g黑棕色至黑色的沉淀。所得的物质在蒽酮反应和水合茚三酮反应中均为阳性。经柱色谱纯化后，发现该物质为葡聚糖/蛋白质复合物，其中葡聚糖与蛋白质的比为96∶4。TSK凝胶GMPWXL柱上的凝胶过滤色谱检验的结果是，发现其分子量为约1000000。当其葡聚糖部分进行水解并用高效液相色谱定性检验中性葡聚糖时，只检测到了葡萄糖。用自动氨基酸分析仪(仅色氨酸用高效液相色谱分析)检验其蛋白质部分，结果表明该蛋白质由谷氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、色氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸等组成。(2)抗肿瘤试验分别将上述第(1)步中得到的物质(下文称之为物质A)和以步骤(1)同样的方式只是没有进行加入醇至低浓度(终体积浓度为20-70％)以除去液面上或液体中的漂浮物质或附着于容器壁上的物质的步骤而制得的干燥物质(下文称之为物质B)溶解于生理盐水中。对移植了MM-46癌的C3H小鼠腹膜内注射各溶液10次，每次剂量为0.1mg/kg，以此来检验其对肿瘤生长抑制的效果，结果如表1所示。表1 (每组15只小鼠，※t-测验有5％或更低的显著性差异)。按如下公式测定肿瘤生长抑制(％)肿瘤生长抑制(％)=×100施用物质A的那组对肿瘤生长的抑制效果显著强于施用物质B组的抑制效果。施用各试验物质5天之后，从对照组(只施用生理盐水)、施用物质A的组和施用物质B的组采集巨噬细胞和杀伤T细胞，根据对3H-胸腺嘧啶的吸收量来测细胞免疫活性细胞的活性。结果如表2所示。表2 从上述结果可以看出，物质A比物质B表现出较强的抗肿瘤活性和免疫增强活性。工业实用性上述结果表明，通过将由于向Grifola的热水提水液中加入醇至终体积浓度为20-70％而产生液面漂浮和液体中悬浮的物质或附地容器壁上的物质除去，可提高免疫增强活性和肿瘤生长抑制活性。因此，本专利技术的特征在于，不是简单地提取β-葡聚糖，而是通过简单的方法从有限的资源中有效地制备具有免疫增强活性的葡聚糖/蛋白质复合物。按照本专利技术制得的物质是低毒性和高安全性的，并本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由下列步骤制备的葡聚糖／蛋白质复合物： （１）用水对Ｇｒｉｆｏｌａ的菌丝体或子实体进行热提取； （２）向所得的水溶性提取液中加入醇至终体积浓度为２０－７０％，使所述的提取液在容器中于１－２５℃下静置，除去漂浮在液面上或液体中的物质或附着在容器壁上的物质；以及 （３）向所述的提取液中加入醇至终体积浓度为８０－９９％，使所述的提取液在１－２５℃静置，并回收产生的沉淀。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：难波宏彰，久保惠子，
申请(专利权)人：株式会社雪国梅泰克，
类型：发明
国别省市：JP[日本]