用于产生5‑羟基色氨酸的微生物途径制造技术

5‑羟基色氨酸(5‑HTP)为血清素的前体，产生于微生物宿主细胞中。修饰的细菌的苯丙氨酸4‑羟化酶(P4H)催化色氨酸5‑羟基化反应。任选地，该宿主细胞包括辅因子再生机制，这样允许在不补充外源辅因子的情况下连续产生5‑HTP。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求2014年5月16日提交的美国临时申请序列号61/994,413的权益，该申请通过引用以其全文结合在此。背景抑郁症是一种常见的精神障碍，威胁世界上数百万的人。中枢神经系统(CNS)中神经递质血清素不足被认为是抑郁症的重要生理因素。5-羟基色氨酸(5-HTP)在人类和动物体内是血清素的直接生物合成前体。已经示出它在治疗抑郁症中是临床有效的，伴随相对少的副作用。在大多数欧洲国家，5-HTP是用于多种治疗目的的常用的处方药；然而在北美市场中，将它作为“非处方”的膳食补充剂销售。除了抑郁症，5-HTP已经示出在治疗失眠、纤维肌痛、肥胖症、小脑共济失调、慢性头痛等中是有效的。(博德塞奥(Birdsall)，替代医学评论(Altern.Med.Rev.)1998:3(4):271-280)，正如在过去二十年进行的研究所证实的，5-HTP可以在例如以下障碍的治疗中具有积极作用：纤维肌痛(卡鲁索(Caruso)等人，国际医疗研究杂志(JIntMedRes.)1990；18:201-209；普特尼(Puttini)等人，国际医疗研究杂志(JIntMedRes.)1992；20:182-189)、失眠(艾特(Attele)等人，替代医学评论(Altern.Med.Rev.)2000；5(3):249-259)、偏头痛以及头痛(里贝罗(Ribeiro)，2000年6月；40(6):451-6)、进食障碍例如多食症(坎贾诺(Cangiano)等人，肥胖相关的代谢紊乱国际杂志(IntJObesRelatMetabDisord.)1998；22:648-654；莎茜(Ceci)等人，神经传递杂志(JNeuralTransm.)1989；76:109-117)(作为管理肥胖症和糖尿病的辅助手段)、以及热潮(柯西奥(Curcio)等人，替代医学评论(Altern.Med.Rev.)2005；10(3):216-21；弗里德曼(Freedman)，欧洲更年期杂志(Maturitas.)2010年4月；65(4):383-5)。5-HTP还被认为是一种潜在的农场动物的饲料添加剂，是抵抗牛的乳腺炎(杰瑞(Jury)等人，公共科学图书馆综合(PLoSOne.)2015年2月17；10(2):e0117339；派(Pai)等人，国际生物医学研究(BiomedResInt.)2015；2015:364746；豪斯曼(Horseman)等人，动物生物科学年度评论(AnnuRevAnimBiosci.)2014年2月2:353-74)，以及在哺乳动物的泌乳功能调节(马歇尔(Marshall)等人，乳腺肿瘤生物学(JMammaryGlandBiolNeoplasia.)2014年3月；19(1):139-46；科利尔(Collier)等人，家畜内分泌学(DomestAnimEndocrinol.)2012年8月；43(2):161-70；赫尔南德斯(Hernandez)等人，内分泌学杂志(JEndocrinol.)2009年10月；203(1):123-31)中的一种预防性或者治疗性药剂，这样5-HTP具有大的潜力以增加所述动物的乳产量。在某些禽类中(例如：鸡)，5-HTP显现与昼夜周期调节(托马斯(Thomas)等人，细胞与分子神经生物学(Cell.Mol.Neurobiol.)1991,11(5):511-527)以及其他的积极健康效应(莫内瓦(Moneva)等人，保加利亚农业科学杂志(BulgarianJ.AgSci.)200814(4):424-431)相关联，在动物生长和生产能力中有积极影响。目前，5-HTP通过从加纳籽的种子中提取而产生，它是生长在非洲的木本的攀缘灌木。该原材料的供应依赖于季节和地区，已限制其有成本效益的生产和广泛的临床应用。此外，来自加纳籽的5-HTP被一种称为顶峰X的化合物污染，导致USDA暂时地令该补充剂在美国下架。目前，5-HTP的大宗批发价格在400到1000美元/kg之间变动。尽管当前的生产成本高而且供应有限，5-HTP的全球市场仍然约120,000kg(整批价值50-100百万美元)，每年的增长率为大约7％。5-HTP终产物甚至更贵，并且终产物的零售市场价值更高。在2012年，北美代表约48％的市场，随后是欧洲和亚太地区，主要的市场细分是人类营养补充物。正在出现的市场细分(例如：动物营养，人类治疗辅佐剂)可能以比预测的非处方人类营养补充物快得多的速度增长。专利技术概述本专利技术提供了可用于微生物生产5-羟基色氨酸(5-HTP)(血清素(5-羟色胺)的前体)的化合物、组合物以及方法。将宿主菌进行代谢工程改造以表达非天然存在的酶，该酶催化色氨酸经由色氨酸的5-羟基化作用向5-HTP的转化。优选的宿主细胞是过度产生起始原料色氨酸的细胞。任选地，将该宿主细胞进一步工程化以包括辅因子再生机制，允许在不补充外源辅因子的情况下连续产生5-HTP。本专利技术可以导致5-HTP的改进的滴度并且允许低成本、大规模的生产，而不限于补充前体或辅酶。在一个方面，该专利技术包括基因工程化的微生物细胞，例如细菌或酵母细胞，该基因工程化的微生物细胞包括细菌的苯丙氨酸-4-羟化酶(P4H)，已将此酶进行修饰以示出与相应的野生型P4H相比对色氨酸增加的亲和性。该修饰的细菌酶可以基于或衍生自例如来自假单胞菌属(Pseudomonas)、色杆菌属(Chromobacterium)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)或黄单胞菌(Xanthomonas)的P4H。在一个实施例中，修饰的细菌P4H包括野油菜黄单胞菌P4H的氨基酸位置98、179以及231中的任何一个、任何两个或全部三个处的氨基酸突变，或者在来自另一个物种(优选是细菌物种)的细菌P4H酶中的任何一个、任何两个或全部三个相应氨基酸位置处的氨基酸突变(参见例如图5F)。氨基酸突变的例子包括选自下组的任何一个、任何两个或全部三个突变，该组由以下各项组成：L98Y、W179F和Y231C(根据野油菜黄单胞菌P4H氨基酸序列编号)。示例的修饰的苯丙氨酸-4-羟化酶(P4H)是至少并入突变W179F的野油菜黄单胞菌的苯丙氨酸-4-羟化酶。任选的，修饰的细菌P4H进一步包括至少一个另外的突变，该另外的突变是相应于野油菜黄单胞菌P4H的氨基酸位置85、223和282的任何一个、任何两个或全部三个的位置处，或者在来自另一个物种(优选细菌物种)的细菌P4H酶中的任何一个、任何两个或全部三个相应氨基酸位置处。任选的，该基因工程化的细菌或酵母细胞是已经被基因工程化以过度产生或积累色氨酸的细胞。任选的，该基因工程化的细菌或酵母细胞包括辅因子再循环系统，该辅因子再循环系统包括喋呤-4α-甲醇胺脱水酶(PCD)和二氢单喋呤还原酶(dihydromonapterinreductaseenzyme，DHMR)中的至少一个。优选地，该细胞包括喋呤-4α-甲醇胺脱水酶(PCD)和二氢单喋呤还原酶(DHMR)二者。在一个实施例中，二氢单喋呤还原酶(DHMR)是由大肠杆菌基因folM编码。基因工程化的细菌或酵母细胞可以包括编码修饰的P4H、PCD和/或DHMR酶中任一个或全部的一个或多个质粒。这些酶可以由分开的质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程化的细菌细胞，该基因工程化的细菌细胞包括修饰的细菌苯丙氨酸‑4‑羟化酶(P4H)，与相应的野生型P4H相比，该修饰的细菌苯丙氨酸‑4‑羟化酶具有对色氨酸增加的亲和性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.05.16 US 61/994,4131.一种基因工程化的细菌细胞，该基因工程化的细菌细胞包括修饰的细菌苯丙氨酸-4-羟化酶(P4H)，与相应的野生型P4H相比，该修饰的细菌苯丙氨酸-4-羟化酶具有对色氨酸增加的亲和性。2.如权利要求1所述的基因工程化的细菌细胞，该基因工程化的细菌细胞被基因工程化为过度产生或积累色氨酸。3.如权利要求1或2所述的基因工程化的细菌细胞，进一步包括辅因子再循环系统，该辅因子再循环系统包括喋呤-4α-甲醇胺脱水酶(PCD)和二氢单喋呤还原酶(DHMR)中的至少一个。4.如权利要求3所述的基因工程化的细菌细胞，其中该二氢单喋呤还原酶是由大肠杆菌基因folM编码。5.如前述权利要求中任一项所述的基因工程化的细菌细胞，其中该修饰的细菌P4H衍生自假单胞菌属、色杆菌属、罗尔斯通氏菌属或黄单胞菌属。6.如前述权利要求中任一项所述的基因工程化的细菌细胞，其中该修饰的细菌P4H包括在野油菜黄单胞菌P4H的氨基酸位置98、179和231中的任何一个、任何两个或全部三个处的氨基酸突变，或者在来自另一个物种的细菌P4H酶中的任何一个、任何两个或全部三个相应氨基酸位置处的氨基酸突变。7.如权利要求6所述的基因工程化的细菌细胞，其中该突变包括选自下组的任何一个、任何两个或任何三个突变，该组由以下各项组成：野油菜黄单胞菌P4H的L98Y、W179F和Y231C；或者在来自另一个物种的细菌P4H酶中的相应氨基酸位置的任何一个、任何两个或任何三个突变。8.如权利要求6或7所述的基因工程化的细菌细胞，其中该修饰的细菌P4H进一步包括至少一个另外的突变，所述另外的突变在野油菜黄单胞菌P4H的氨基酸位置85、223和282中的任何一个、任何两个或全部三个处，或者在来自另一个物种的细菌P4H酶中的任何一个、任何两个或全部三个相应氨基酸位置处。9.如前述权利要求中任一项所述的基因工程化的细菌细胞，该细菌细胞包含第一...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫亚军，林宇恒，
申请(专利权)人：乔治亚大学研究基金公司，
类型：发明
国别省市：美国;US