利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法，选用免疫反应能力更强，血清脂肪含量低的山羊为原料，将ApoA1抗原经皮下注入山羊腹股沟外并进行多次加强免疫，共进行七次免疫注射，每次注射较上一针ApoA1抗原量逐渐增加，能够不断激活T细胞和B细胞的应答反应，更好产生有效抗体，使其产生高效羊抗ApoA1抗体效价可达1:32以上，大幅度提高了抗体效价，增加稳定性以及灵敏度，为生物试剂厂提供原料、为医疗诊断提供方便，使山羊产生了高的应用价值和效益，同时降低了试剂厂家一半的成本，经济价值和社会价值显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗原的制备方法领域，尤其涉及一种利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法。
技术介绍
载脂蛋白A1(ApoA1)是apoAApoA1族最多的一种组份，apoA1为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量为28300D，是高密度脂蛋白(HDL)的主要载脂蛋白。是生物试剂的重要原料，现有的生产方法采用传统的免疫方式，产量与效价较低，已无法满足日益增长的使用需求。中国专利CN103467600A(利用湖羊生产抗ApoA1多抗血清的方法)利用湖羊，获取了抗体效价可达1:16的抗APOA1多抗血清，但还是存在抗体效价不足、抗体稳定性不好、灵敏度不高的缺陷。因此，需要一种新的技术方案解决上述问题。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的缺陷，本专利技术提出了一种操作方法简单且大幅度提高产量和效价的利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法。技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术所采用的技术方案为：一种利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法，包括以下步骤：(1)免疫原乳剂的制备：将含有ApoA1抗原10mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂为免疫第一针量；第二针将ApoA1抗原量增加为20mg，第三针增加为30mg，第四针增加为40mg，第五针增加为50mg，第六针增加为60mg，第七针增加为70mg，其余相同操作；逐步增加抗原量能够不断激活T细胞和B细胞的应答反应，更好产生有效抗体；(2)山羊免疫第一针：在山羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，颈部两侧2个注射点平均注射；(3)山羊免疫第二针：与第一针间隔十五天注射第二针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，颈部两侧淋巴结左右2个点；与第一针间隔十五天可以更好地激活动物体内免疫细胞产生应答反应.为下一次免疫做更好准备.(4)山羊免疫第三针：与第二针间隔十天注射第三针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(5)山羊免疫第四针：与第三针间隔十天注射第四针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(6)山羊免疫第五针：与第四针间隔十天注射第五针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(7)山羊免疫第六针：与第五针间隔十天注射第六针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(8)山羊免疫第七针：与第六针间隔十天注射第七针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(9)与第七针注射间隔十天对免疫的山羊动脉采血，血液放入水箱中，在温度40℃下保存1h，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱进行保存，保存温度为4-8℃；(10)对步骤(9)所得抗血清进行效价测定。在一些实施方式中，步骤(1)所述的第一针使用的弗氏佐剂为弗氏完全佐剂。在一些实施方式中，步骤(1)所述的第二针-第七针使用的弗氏佐剂为弗氏不完全佐剂。在一些实施方式中，步骤(10)所述的效价测定的方法为琼扩方法。有益效果：本专利技术提供的一种利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法，选用免疫反应能力更强，血清脂肪含量低的山羊为原料，将ApoA1抗原经皮下注入山羊腹股沟外并进行多次加强免疫，共进行七次免疫注射，每次注射较上一针ApoA1抗原量逐渐增加，能够不断激活T细胞和B细胞的应答反应，更好产生有效抗体，使其产生高效羊抗ApoA1抗体效价可达1:32以上，大幅度提高了抗体效价，增加稳定性以及灵敏度，为生物试剂厂提供原料、为医疗诊断提供方便，使山羊产生了高的应用价值和效益，同时降低了试剂厂家一半的成本，经济价值和社会价值显著。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明：实施例：实验对象：选用山羊公羊50只，选择体重35公斤左右的健康羊，免疫前全部打上耳标，羊群采用圈养，结合放养，保持正常体况，避免羊只过肥，提高免疫力，自动饮水器，每天牧草供给，适量添加精料、醋糟、麸皮和维生素等。实验方法：一种利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法，包括以下步骤：(1)免疫原乳剂的制备：将含有ApoA1抗原10mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂为免疫第一针量；第二针将ApoA1抗原量增加为20mg，第三针增加为30mg，第四针增加为40mg，第五针增加为50mg，第六针增加为60mg，第七针增加为70mg，其余相同操作；其中ApoA1抗原为人的ApoA1接种0.1ml(合抗原10mg)与1.9ml无菌PBS弗氏佐剂2ml制成免疫原乳剂备用；其中第一针免疫注射使用的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏完全佐剂，其余免疫中即第二至七针注射的免疫原乳剂乳化时采用的弗氏佐剂是弗氏不完全佐剂；(2)山羊免疫第一针：在山羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，颈部两侧2个注射点平均注射；(3)山羊免疫第二针：与第一针间隔十五天注射第二针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，颈部两侧淋巴结左右2个点；(4)山羊免疫第三针：与第二针间隔十天注射第三针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(5)山羊免疫第四针：与第三针间隔十天注射第四针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(6)山羊免疫第五针：与第四针间隔十天注射第五针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(7)山羊免疫第六针：与第五针间隔十天注射第六针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(8)山羊免疫第七针：与第六针间隔十天注射第七针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(9)与第七针注射间隔十天对免疫的山羊动脉采血，血液放入水箱中，在温度40℃下保存1h，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱进行保存，保存温度为4-8℃。效价测定：对步骤(9)所得抗血清采用琼扩的方法进行效价测定：1.配制琼脂：称取1.2g琼脂粉，加入100ml生理盐水中，水浴加热溶解后，以115℃灭菌10分钟；灭菌结束后，取出琼脂溶液，冷却至70℃左右，用吸管吸取琼脂液，加入干净的平皿中，每块平皿16ml，待冷却后收起平皿，放于2～8℃冰箱中保存，可保存2周；用前在平皿上用梅花打孔器打孔，中间孔加入抗原，外周孔加稀释后的待检血清。2.样品血清稀释：取出96孔细胞培养板或血凝板，在每孔中加入25μl生理盐水或PBS；在每行的第1列孔中加入25μl样品血清，从第1孔向后倍比稀释至第6孔。3.加样检测：取出打好梅花孔的琼脂平皿，在外周孔中按顺序加入倍比稀释的样品血清，每孔约加20μl，以孔加满为宜；在梅花孔的中央孔中加入上述分离出的抗血清；将加好样的琼脂平皿放入湿盒中，置37℃过夜，观察外周孔与中央孔沉淀线出现位置，计算样品血清的效价。4.血清效价评定：测得第4孔有沉淀线(凝集反应)说明测定此批次抗血清的效价为1:32。从上述效价测定结果可看出：本专利技术产生高效羊抗ApoA1抗体效价可达1:32以上，大幅度提高了抗体效价，增加稳定性以及灵敏度，为生物试剂厂提供原料、为医疗诊断提供方便，使山羊产生了高的应用价值和效益，同时降低了试剂厂家一半的成本，经济价值和社会价值显著。应当指出，以上具体实施方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)免疫原乳剂的制备：将含有ApoA1抗原10mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂为免疫第一针量；第二针将ApoA1抗原量增加为20mg，第三针增加为30mg，第四针增加为40mg，第五针增加为50mg，第六针增加为60mg，第七针增加为70mg，其余相同操作；(2)山羊免疫第一针：在山羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，颈部两侧2个注射点平均注射；(3)山羊免疫第二针：与第一针间隔十五天注射第二针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，颈部两侧淋巴结左右2个点；(4)山羊免疫第三针：与第二针间隔十天注射第三针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(5)山羊免疫第四针：与第三针间隔十天注射第四针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(6)山羊免疫第五针：与第四针间隔十天注射第五针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(7)山羊免疫第六针：与第五针间隔十天注射第六针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(8)山羊免疫第七针：与第六针间隔十天注射第七针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(9)与第七针注射间隔十天对免疫的山羊动脉采血，血液放入水箱中，在温度40℃下保存1h，待血清充分析出，经离心沉淀分离出抗血清，放进冰箱进行保存，保存温度为4‑8℃；(10)对步骤(9)所得抗血清进行效价测定。...

【技术特征摘要】
1.一种利用山羊生产抗ApoA1多抗血清的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)免疫原乳剂的制备：将含有ApoA1抗原10mg的血清0.1ml，无菌PBS1.9ml，弗氏佐剂2ml混合并乳化，得到免疫原乳剂为免疫第一针量；第二针将ApoA1抗原量增加为20mg，第三针增加为30mg，第四针增加为40mg，第五针增加为50mg，第六针增加为60mg，第七针增加为70mg，其余相同操作；(2)山羊免疫第一针：在山羊的前后腹股沟，每腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，皮下注射，颈部两侧2个注射点平均注射；(3)山羊免疫第二针：与第一针间隔十五天注射第二针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点，颈部两侧淋巴结左右2个点；(4)山羊免疫第三针：与第二针间隔十天注射第三针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(5)山羊免疫第四针：与第三针间隔十天注射第四针，在前后腹股沟分2个区域注射，总共12个注射点；(6)山羊免疫第五针：与第四针...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐志伟，
申请(专利权)人：江苏丘陵地区镇江农业科学研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32