检测β-内酰胺抗生素抗性的细菌的诊断方法技术

本发明专利技术涉及使用blaCTX-M特异性寡核苷酸探针确定生物样品中的β-内酰胺抗性细菌的存在的方法。提供了此类探针以及适于扩增编码CTX-M的DNA的引物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利
本专利技术涉及分子诊断、特别是用于确定生物样品中的β-内酰胺抗性细菌的存在的领域。专利技术背景细菌对抗微生物药诸如抗生素的抗性在全世界是严重且正在发展的健康问题。在革兰氏阴性细菌间，抗药性的最突出原因是β-内酰胺酶的出现，所述β-内酰胺酶破坏β-内酰胺抗生素的β-内酰胺环。超广谱β-内酰胺酶(ESBL)(β-内酰胺酶的重要亚群)能够赋予对机构和门诊护理中使用的最常见的β-内酰胺抗生素(诸如青霉素类、头孢菌素类和单环内酰胺类)的抗性。ESBL也可以赋予对非β-内酰胺抗生素诸如喹诺酮类、氨基糖苷类和甲氧苄氨嘧啶的多药抗药性，缩小了治疗选项。产生ESBL的细菌最初在1980年代早期发现于住院患者间，特别是重症监护病房中的最脆弱的患者，但现在也在基于社区的患者间传播。ESBL相关感染症状主要包括尿路感染，其次包括腹腔内感染。逃至血流后，产生ESBL的细菌可导致败血症或其他严重到足以需要住院治疗的感染。迄今在世界上已经鉴定了超过十种不同类型的ESBL。到目前为止，TEM和SHV酶已经形成最常见的ESBL类型，但从21世纪开始，已经越来越清楚的是，ESBL类型的流行率的变化正在发生。CTX-M酶已经在很大程度上代替且在数量上超过其他类型的ESBL，且现在被认为是临床上最重要亚类的ESBL。据推测，编码CTX-M的blaCTX-M基因源自克吕沃尔氏属种(Kluyveraspp)的染色体编码的酶，但如今作为具有在不同的细菌种群之间移动的能力的质粒缀合基因存在。blaCTX-M的初始载体包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)和奇异变形杆菌(Proteusmirabilis)，但进一步携带blaCTX-M的细菌菌株越来越出现。迄今已经报道了超过124种不同的CTX-M类型。对于CTX-M类型的精确分类没有一致意见，但根据D'Andrea(Int.J.Med.,2013.印刷前电子出版)，主要的CTX-M组群是CTX-M-1、-2、-8、-9、-25和KLUC。各亚组内的氨基酸变化小于5％，而组群间的变化为至少10％。ESBL产生者的检测和鉴定是至关重要的，不仅因为受感染患者的延迟识别和不适治疗已经与增加的死亡率相关，而且还限制这些多药抗性微生物的传播。广泛使用的灵敏性测试诸如纸片扩散和稀释抗微生物敏感性测试以及验证测试(大多基于克拉维酸和头孢菌素之间的协同作用)便宜，且相对容易使用。然而，此类测试是费时的，且受困于有限的灵敏度。在基因水平测定ESBL代表用于鉴定和分型blaCTX-M基因的替代方法。为此，已经开发了许多基于PCR的测定法。此类测定法是精确和灵敏的，但其中许多需要一连串的扩增子特异性测序引物以及PCR产物的劳动密集且耗时的分析，例如通过DNA测序。可以，至少部分地，通过通用的简并CTX-M引物或通过采用如Birkett等人于J.Med.Microbiol.,2007,56:52-55中所公开的基于实时PCR的方法(其允许PCR产物的同时扩增和分析)来避免这些缺点。与在核苷酸水平鉴定blaCTX-M基因型的方法相关的一个进一步缺点是伴随检测高度同源的非blaCTX-M基因序列，特别是产酸克雷伯氏菌的染色体K1基因，引起假阳性结果，因此，有必要使用验证测试。专利公开US2009/0163382公开了用于基于许多不同的抗生素抗性基因检测抗生素抗性的细菌物种的基于微阵列的方法的引物和探针。然而，通过该方法仅检测到124种不同的目前已知的CTX-M类型中的一部分。此外，Fu等人(J.Microbiol.Methods,2012,89:110-118)公开了抗药基因检测的DNA微阵列。该阵列含有来自17类抗药基因的总共115种探针。然而，通过该方法仅检测到124种不同的目前已知的CTX-M类型中的一部分。为了确保患者安全性、ESBL的最佳治疗和扩散控制，本领域需要用于确定生物样品中的ESBL的存在的高度灵敏和特异的宽范围测定法。专利技术概述在一个方面，本专利技术涉及确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在或不存在的方法。所述方法包括以下步骤：a)提供怀疑含有产生CTX-M的细菌的生物样品；b)如果有的话，扩增所述样品中的编码CTX-M的DNA；和c)使用至少一个探针检测扩增的DNA，所述探针与blaCTX-M基因的区域杂交，所述区域对应于CTX-M-15中的SEQIDNO:23的核苷酸397-617的区域，且所述探针包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:72中记载的核酸序列的至少10个连续核苷酸；其中步骤b)和c)可以单独或同时进行。在本方法的一些实施方案中，所述探针与blaCTX-M基因的区域杂交，所述区域对应于CTX-M-15中的SEQIDNO:23的核苷酸503-539的区域。本领域技术人员可以容易识别其他CTX-M变体中的对应blaCTX-M区域。换言之，本实施方案不限于与blaCTX-M-15杂交的探针，但涵盖与任何blaCTX-M变体杂交的探针。在本方法的一些其他实施方案中，所述探针可以二分为5'-探针和3'-探针。在一些又进一步实施方案中，所述5'-探针包含SEQIDNO:34、35、或63中记载的核酸序列，和/或所述3'-探针包含SEQIDNO:44、45、或70中记载的核酸序列。所述探针也可以与本文公开的序列具有至少80％的序列同一性，只要它们保留它们在正常杂交条件下与blaCTX-M基因杂交的能力。在本方法的一些其他实施方案中，用包含SEQIDNO:1、2、或61中记载的核酸序列的正向引物和包含SEQIDNO:11或12中记载的核酸序列的反向引物进行扩增步骤。所述引物也可以与本文公开的序列具有至少80％的序列同一性，只要它们保留它们在正常PCR引物杂交条件下扩增blaCTX-M基因的能力。在进一步方面，本专利技术提供分别能够扩增和杂交blaCTX-M的寡核苷酸引物和探针。所述探针可以包含与SEQIDNO:34、35、44、45、63、或70中任一者中记载的序列或与SEQIDNO:24或SEQIDNO:72的至少10个连续核苷酸具有至少80％序列同一性的核酸序列，只要它们保留它们在正常杂交条件下与blaCTX-M基因杂交的能力。在一些实施方案中，还提供包含至少三种不同的寡核苷酸分子的寡核苷酸探针混合物，所述寡核苷酸分子彼此独立地各自包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:72中包含的核酸序列的至少10个本文档来自技高网...

【技术保护点】
确定生物样品中的产生CTX‑M的细菌的存在或不存在的方法，其中所述方法包括以下步骤：a) 提供怀疑含有产生CTX‑M的细菌的生物样品；b) 如果有的话，扩增所述样品中的编码CTX‑M的DNA；和c) 使用至少一种探针检测扩增的DNA，所述探针与blaCTX‑M基因的区域杂交，所述区域对应于CTX‑M‑15中的SEQ ID NO:23的核苷酸397‑617的区域，且所述探针包含SEQ ID NO:24或SEQ ID NO:72中记载的核酸序列的至少10个连续核苷酸，其中步骤b)和c)可以单独或同时进行。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.07 FI 201358221.确定生物样品中的产生CTX-M的细菌的存在或不存在的方法，其中所述方法包括以
下步骤：
a)提供怀疑含有产生CTX-M的细菌的生物样品；
b)如果有的话，扩增所述样品中的编码CTX-M的DNA；和
c)使用至少一种探针检测扩增的DNA，所述探针与blaCTX-M基因的区域杂交，所述区域
对应于CTX-M-15中的SEQIDNO:23的核苷酸397-617的区域，且所述探针包含SEQIDNO:
24或SEQIDNO:72中记载的核酸序列的至少10个连续核苷酸，
其中步骤b)和c)可以单独或同时进行。
2.根据权利要求1的方法，其中所述区域对应于CTX-M-15中的SEQIDNO:23的核苷酸
503-539的区域。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述探针是至少三种探针的混合物，所述探针各自
包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:72中记载的不同的核酸序列的至少10个连续核苷酸。
4.根据权利要求3的方法，其中所述探针混合物包含九种或十六种探针，所述探针各自
分别包含SEQIDNO:24或SEQIDNO:72中记载的不同的核酸序列的至少10个连续核苷酸。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中所述探针已经被二分为5'-探针和3'-探
针。
6.根据权利要求5的方法，其中所述5'-探针包含SEQIDNO:34、35或63中记载的核酸
序列，且所述3'-探针包含SEQID...

【专利技术属性】
技术研发人员：T塞佩，S维特福斯，
申请(专利权)人：图尔库大学，
类型：发明
国别省市：芬兰;FI