一种检测奶制品中β-内酰胺酶的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测奶制品中β-内酰胺酶的方法。所述方法设计了一个能被β-内酰胺酶特异性催化的荧光底物探针，该荧光底物探针的主要结构是由荧光素的母环和β-内酰胺类抗生素通过化学合成得到。β-内酰胺酶可以催化荧光底物探针发出强烈的荧光，根据反应得到的荧光强度计算β-内酰胺酶的含量。通过本发明专利技术的方法能检测到0.1ng/mL的β-内酰胺酶，比传统的ELISA方法灵敏度提高了两个数量级，检测时间缩短到45min，具有特异性强、灵敏度高、简便、检测快速等优点，而且可以大大降低检测费用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫检测
，具体涉及一种检测奶制品中0-内酰胺酶的方 法，尤其涉及一种基于荧光底物探针的荧光值定量检测奶制品中0-内酰胺酶的方法
技术介绍
目前，青霉素和头孢菌素作为内酰胺类药物是治疗牛乳腺炎的首选，是牛奶 中最常见的残留抗生素，而乳品中残留的抗生素危害食品安全和人体健康。我国无公害生 鲜牛乳的产品标准中明文规定，生鲜牛乳中氨苄青霉素< 10yg/kg，青霉素不得检出。因 此，国内多数乳品企业对抗生素残留超标的牛乳采取降价收购原则，出于经济利益的驱动， 一些不法奶站为了谋求自己的经济利益，人为地使用一些生物制剂达到降解牛乳中残留的 抗生素的目的，生产人造"无抗奶"。有研宄表明，牛奶中的抗生素分解剂是革兰氏阳性菌产 生的内酰胺酶，是人为添加的，而不是内源性内酰胺酶。内酰胺酶可以分解牛 乳中的抗生素残留使其降到允许量。但是目前为止，尚未有关于内酰胺酶本身及其分 解产物对人体是否健康的安全性评价标准，所以，国际食品法典委员会、欧盟、美国都不允 许0 -内酰胺酶在食品中使用，我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB-2760)的食品用酶制 剂名单中也不包括内酰胺酶。因此，内酰胺酶是非法的食品添加剂，目前国际和国 内均不允许该酶在牛奶中作为添加剂使用。 因此，确立针对这种人造"无抗奶"的违规情况，相应的检测方法具有十分重要的 意义。目前比较成熟的检测方法主要包括高效液相色谱法、碘量法、微生物法、头孢菌素显 色法、酸量法和免疫学方法。 (1)微生物法可以定性和定量地检测牛奶中的内酰胺酶。该方法可以检测出 牛奶中未反应完全（未失活）的内酰胺酶，可用于检测未经过任何加工的牛奶，检出限 较低。但也存在检测种类有限、实验周期长、只能给出定性结论等局限性。不适用于快速、 大规模的样品检测，但是，微生物法仍然是实验室检测牛奶中内酰胺酶的主要方法。 (2)碘量法作为快速筛选方法，该法方便快捷、操作简单、试剂易得，检测革兰阳 性细菌胞外酶阳性率高，为实验室所普遍使用。该方法可检出牛奶中已反应及未反应的 0-内酰胺酶，可用于检测鲜奶及奶制品中的内酰胺酶，检出限较高。但该方法对反应 时间等条件要求较严格，有假阳性和假阴性现象，每次试验均需要设置阳性和阴性对照，而 且灵敏度较差，重现性差。碘量法虽然经典、快速，但其试剂配制较复杂，淀粉试剂易失效， 必须现配现用。 (3)酸量法简单易行，重复性好，最易获取结果，且较灵敏，结果稳定性好，假阳性 和假阴性结果较少，适用于大多数实验室，虽然快速检测，但检测灵敏度偏低，且不能用于 酶动力学分析。 (4)高效液相色谱法具有检测时间短、可以定量分析等优点，但是存在灵敏度低、 检测成本高、前处理操作复杂等缺点。 (5)头孢菌素显色法：该方法比较方便快捷，操作简单，但是所用试剂价格昂贵， 定量检测不准确。 (6)免疫分析法可通过特异性抗体的制备，直接识别目标分子本身，特异性强，灵 敏度高，成本低，不需要大型复杂的设备即可进行，但是传统的酶联免疫方法需要多步洗 涤，比较耗时耗力，因此其使用也受到一定的限制。 CN101710122A公开了一种快速免疫检测牛奶中0-内酰胺酶的方法，该方法利 用包被与酶标板上的鼠抗0-内酰胺酶单克隆抗体，与兔抗0-内酰胺酶多克隆抗体和 辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体组成三抗体夹心法试剂，进行三抗体夹心法免疫学检测。 CN103134937A公开了一种检测牛奶中0 -内酰胺酶的双抗体夹心法，该方法通过政策的免 疫、细胞融合、筛选后得到15株0 -内酰胺酶单克隆抗体，并与辣根过氧化物酶进行两两配 对，以0 -内酰胺酶为标准品建立了 0 -内酰胺酶的夹心ELISA分析方法。但这些方法都 需要制备抗体，多次洗涤，耗时耗力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种检测奶制品中0 _内酰胺酶的方法，特别是一种基于 荧光底物探针的荧光值定量检测奶制品中0-内酰胺酶的方法。该检测方法具有灵敏度 高、特异性强、快速、简便等优点。 为达此目的，本专利技术采用以下技术方案： 本专利技术提供了一种检测奶制品中0 _内酰胺酶的方法，该方法以荧光素-0 _内酰 胺类抗生素作为荧光底物探针进行酶促反应，根据反应得到的荧光强度计算内酰胺酶 的含量。 本专利技术中的荧光底物探针可以被0-内酰胺酶特异性地催化，其内酰胺键断裂， 然后变成两个分子，其中一个为荧光素的基本结构单元，其荧光得到很大程度地增强，而该 荧光强度和样品中的内酰胺酶的含量成正比，因此可以快速、特异性地检测内酰胺 酶的含量。 本专利技术中，所述荧光底物探针的浓度为0.1-lyM，例如可以是0.lyM、0. 2yM、 0? 3yM、0. 4yM、0. 5yM、0. 6yM、0. 7yM、0. 8yM、0. 9yM或 1yM，优选为 0? 4yM。 优选地，所述荧光底物探针对-内酰胺酶具有广谱性。 本专利技术中，所述荧光底物探针由荧光素和0-内酰胺类抗生素通过有机合成的方 式合成。本专利技术的荧光底物探针被0-内酰胺酶特异性催化的反应过程如下：【主权项】1. 一种检测奶制品中0-内酰胺酶的方法，其特征在于，所述方法以荧光素-0-内酰 胺类抗生素作为荧光底物探针进行酶促反应，根据反应得到的荧光强度计算内酰胺酶 的含量。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述荧光底物探针的浓度为0. 1-1yM，优 选为0? 4yM; 优选地，所述荧光底物探针对内酰胺酶具有广谱性。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述荧光底物探针由荧光素和0 -内 酰胺类抗生素通过有机合成的方式合成； 优选地，所述内酰胺类抗生素为青霉素、头孢菌素、头霉素或硫霉素中的任意一 种，优选为青霉素或头孢菌素。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述酶促反应时间为5-60min， 优选为l〇_30min，进一步优选为15min。5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括在酶促反应前，进 行内酰胺酶的富集； 优选地，所述富集为利用免疫磁珠进行富集。6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 将免疫磁珠表面偶联上0 _内酰胺酶抗体，得到特异性识别0 _内酰胺酶的免疫磁 珠探针； (2) 将步骤（1)得到的免疫磁珠探针置于待测分析液中，形成抗原-抗体免疫磁珠复合 物； (3) 将步骤（2)得到的复合物进行磁分离，从而实现内酰胺酶的富集，得到免疫磁 珠-0-内酰胺酶复合物； (4) 向步骤（3)得到的免疫磁珠-0 -内酰胺酶复合物中加入荧光底物探针进行酶促反 应，根据反应得到的荧光强度计算内酰胺酶的含量。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（1)所述免疫磁珠为超顺纳米磁珠； 优选为粒径在200-2000nm的超顺纳米磁珠； 优选地，所述免疫磁珠为具有60-100emu/g的比饱和磁化强度的免疫磁珠； 优选地，所述偶联为共价偶联。8. 根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (1) 采用比饱和磁化强度为60-100emu/g，粒径在200-2000的超顺纳米磁珠，通过共价 偶联的方式将识别内酰胺酶的抗体偶联在超顺纳米磁珠的表面，制备本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测奶制品中β‑内酰胺酶的方法，其特征在于，所述方法以荧光素‑β‑内酰胺类抗生素作为荧光底物探针进行酶促反应，根据反应得到的荧光强度计算β‑内酰胺酶的含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋兴宇，陈翊平，吴景，曹丰晶，张晓青，王卓，牛亚静，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11