本发明专利技术涉及一种检测茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶活力的方法，包括：(1)粗酶液的制备；(2)粗酶液中蛋白质含量P的检测；(3)将粗酶液加入茶氨酸溶液或谷氨酰胺溶液得到水解反应体系样品，反应完成后离心，取上清液；(4)利用高效薄层色谱检测上清液中水解反应产物谷氨酸的吸光值，代入线性方程，计算得到谷氨酸的浓度N，进而计算得到谷氨酸含量M、茶氨酸水解酶活力或谷氨酰胺水解酶活力。本发明专利技术所述方法具有高通量、效率高的特点，为研究茶树体内茶氨酸代谢、茶氨酸水解酶和谷氨酰胺水解酶的分离纯化、酶蛋白的基因克隆及其功能验证奠定了坚实的实验技术基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物材料检测
，具体设及茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水 解酶的酶活检测方法。
技术介绍
阳00引茶氨酸灯heanine，N-乙基-丫-k谷氨酷胺）系茶树中特征性非蛋白质氨基酸。 目前仅在覃狂erocomusbadius)和某些山茶属植物（CamelliajaponicaandCamellia sasanqua)中有见报道。茶氨酸占茶树新梢芽叶游离氨基酸总量的70%左右，是绿茶品质 形成的重要影响因子。同时，茶氨酸具有镇静安神、抗癌、抗抑郁等重要的生理活性及药理 功能。 茶氨酸代谢过程中茶氨酸合成酶、茶氨酸水解酶直接参与了茶氨酸的合成与分 解，谷丙转氨酶、丙氨酸脱簇酶、谷氨酸脱氨酶、谷氨酷胺合成酶、G0GAT、胺氧化酶等参与了 茶氨酸合成前提物质谷氨酸和乙胺的代谢。茶氨酸的代谢可分为根部茶氨酸的合成与叶部 茶氨酸分解两个过程：茶树根本的丙氨酸脱簇形成的乙胺与谷氨酸在茶氨酸合成酶的作用 下生成茶氨酸；然后转移至叶部，在茶氨酸水解酶的作用下分解成谷氨酸和乙胺，乙胺在胺 氧化酶的作用下形成乙醒参与叶部儿茶素的代谢。 目前国内外有关茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶酶活力的测定方法均采 用高效液相色谱OffLC)检测产物积累。但HPLC方法存在W下缺点：1、方法繁琐，需要对反 应产物萃取分离纯化、浓缩和衍生；2、成本高，需要昂贵的仪器设备及衍生试剂，包括HPLC 系统、巧光检测器、2, 4-二硝基氣苯值NFB)、邻苯二甲醒（OPT)等；3、对人体有毒性，使用的 试剂包括DNFB、OPT、乙酸乙醋、甲醇和乙腊等对人体具有毒性，另外易于污染环境；4、分析 时间长，采用HPLC法检测一个样品需要1-2小时，工作效率不高，无法适用于大规模筛选分 析。而茶氨酸、谷氨酷胺和谷氨酸性质、结构较为接近，目前所知的可实现大规模分析的纸 色谱层析方法又无法将Ξ者完全分离开来，因而也无法用于茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解 酶的活性检测。
技术实现思路
阳0化]本专利技术的目的是提供一种针对茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶活力的高 通量、快速的检测方法，为研究茶树体内茶氨酸代谢、茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶的分 离纯化、酶蛋白的基因克隆及其功能验证奠定了坚实的实验技术基础。 为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 一种检测茶树中茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶酶活力的方法，包括如下步骤： 阳00引 （1)粗酶液的制备； 似粗酶液中蛋白质含量P的检测； (3)将步骤（1)制得的粗酶液平分，一份粗酶液加入茶氨酸溶液或谷氨酷胺溶液 得到水解反应体系样品，反应完成后离屯、，取上清液；另一份粗酶液经处理作为对照液； (4)利用高效薄层色谱（HFTLC)检测上清液中水解反应产物谷氨酸的吸光值，代 入线性方程，计算得到谷氨酸的浓度N，进而计算得到谷氨酸含量M、茶氨酸水解酶活力或 谷氨酷胺水解酶活力；其中， 谷氨酸含量Μ=谷氨酸浓度NX水解反应体系样品的体积V; 茶氨酸水解酶活力或谷氨酷胺水解酶活力==Μ/水解时间（min) /Ρ。 本专利技术所述的检测方法中，步骤（1)中，将茶树鲜叶样品加入液氮后，快速研磨成 粉末状，按1. 0 : 0. 2~1. 0 (W/W)加入聚乙締化咯烧酬（PVP巧混匀，再按1 : 10~30 (W/ V)加入-20°C预冷的憐酸缓冲液，匀浆20s，静置3-5分钟，重复3次；冰浴静置比，过4层纱 布，滤液离屯、（4°C，18000Xg，15min)，所得上清液即为粗酶液。其中，所述憐酸缓冲液配方 为：100mM憐酸缓冲盐，ImM二硫苏糖醇值TT)，5%甘油，ImM乙二胺四乙酸二钢巧DTA-Naz)， ImM苯甲基横酷氣（PMSF)。 本专利技术所述的检测方法中，步骤（1)中，将制得的粗酶液进一步利用注射器过凝 胶柱Se地adexG-25,具体操作可参见操作手册；收集前2个柱体积度V)酶液，W作备用。 通过凝胶柱过滤，可有效去除粗酶液中所含茶氨酸、谷氨酷胺和谷氨酸，消除本底干扰。 本专利技术所述的检测方法中，步骤似中，采用蛋白含量试剂盒测定蛋白质含量 (P);本专利技术中采用采用Bio-rad公司的RCDC蛋白含量试剂盒的操作程序测定蛋白质含 量。 为了更准确、快速、低成本的检测茶树中水解酶的酶活力，本专利技术还对水解反应条 件做进一步优化。研究发现，如图2所示，随着反应溫度的上升，茶氨酸水解酶产物和谷氨 酷胺水解酶产物谷氨酸呈现缓慢上升趋势，35°C左右酶活力达到峰值。但由于粗酶液中残 留的多酪等物质，体系反应副产物明显增加；如图3所示，茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶 活力随着抑值升高逐渐上升，抑值8. 5左右时达到最高，随后酶活力开始下降。如图4所 示，茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶活力在反应60min左右达到最大，随着反应继续进行， 反应产物有一定程度的降低。如图5所示，茶氨酸水解酶和谷氨酷胺水解酶活力在茶氨酸 和谷氨酷胺浓度分别为50mM和70mM时，酶活力达到最大；随着底物浓度的继续升高，酶反 应产物趋于稳定，无显著性变化。因此，综合考虑，步骤（3)中，所述水解反应条件为：25~ 38°C水浴，反应30~90min，抑7~9。进一步优选，所述水解反应条件为：35°C水浴，反应 60min，抑8. 5。所述茶氨酸溶液的浓度为50mM;所述谷氨酷胺溶液的浓度为70mM。 本专利技术所述的检测方法中，步骤（3)中，所述对照液配制如下：将粗酶液置于 100°C水浴中处理lOmin，离屯、（4°C，ISOOOXg，15min)，上清液即为对照液。 本专利技术所述的检测方法中，步骤（4)中，所述检测步骤如下：a)、将硅胶预制板（lOcmX10cm)于120°C条件下活化化，后放于干燥器冷却； b)、将展开剂I、II倒入展开缸，静置饱和约30min;其中，展开剂I由正下醇： 丙酬：乙酸：水按体积比14:14:3:4配制，展开剂II由正下醇：丙酬：乙酸：水按体积比 14:14:3:4 配制，并含 0.2% (W/V)巧Ξ酬；C)、取10μL水解反应体系样品，带状点样，点样数6条，宽度8mm，点样高度距底端 10mm；d)、点样后，将硅胶板于展开剂I中展开，待展开剂跑至硅胶板顶端1cm时取出， 热风吹干；待硅胶板冷却至室溫后于展开剂II中展开，待展开剂跑至硅胶板顶端1cm时取 出，热风吹干至条带氨基酸颜色逐渐清晰； e)、将谷氨酸条带自硅胶板刮取于离屯、管中，加入5血75%乙醇，于50°C水浴提 取lOmin，室溫离屯、（12000Xg，lOmin)，取上清液，冷却待测；f)、W75%乙醇作为空白对照，在570皿处测定步骤e)所得上清液的吸光值As7。。 本专利技术所述的检测方法中，步骤（4)中，为了获得精确的谷氨酸含量，每次检测 需W1.OOmmol/L~10.OOmmol/L谷氨酸标准品制作吸光值对谷氨酸浓度的标准曲线，得 出线性方程；将样品测定的Ae^nm代入线性方程中，计算得到谷氨酸浓度（脚，进而计算得 到谷氨酸含量Μ;再利用酶活力计算方法，计算茶氨酸或谷氨酷胺水解酶活力，即在上述 最佳检测条件下，计算每分钟每毫克酶催化形成的酶产物谷氨酸的量，单位为μmol/min/ m邑(protein)。计算公式女曰下： 茶氨酸水解本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测茶树中茶氨酸和谷氨酰胺水解酶酶活力的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)粗酶液的制备；(2)粗酶液中蛋白质含量P的检测；(3)将步骤(1)制得的粗酶液平分，一份粗酶液加入茶氨酸溶液或谷氨酰胺溶液得到水解反应体系样品，反应完成后离心，取上清液；另一份粗酶液经处理作为对照液；(4)利用高效薄层色谱检测上清液中水解反应产物谷氨酸的吸光值，代入线性方程，计算得到谷氨酸的浓度N，进而计算得到谷氨酸含量M、茶氨酸水解酶活力或谷氨酰胺水解酶活力；其中：谷氨酸含量M＝谷氨酸浓度N×水解反应体系样品的体积V；茶氨酸水解酶活力或谷氨酰胺水解酶活力＝M/水解时间(min)/P。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李勤，刘仲华，黄建安，林海燕，张振乾，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。