本发明专利技术公开了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用，属于酶工程领域。本发明专利技术通过对野生天冬酰胺酶的氨基酸序列的N端的进行氨基酸缺失突变，得到了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，并构建了表达该突变体的重组菌。与野生天冬酰胺酶相比，本发明专利技术的突变体的胞外分泌能力提高了3.14倍。本发明专利技术构建的重组菌，发酵生产天冬酰胺酶酶活达到407.6U/mL，生产率达到9.26U/(mL/h)，为目前报道的最高的产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于酶工程领域。
技术介绍
L-天冬酰胺酶（EC3. 5. 1. 1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤 其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物， 对骨髓细胞没有抑制作用。L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia coli、Erwiniachrysanthemi、Β·subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅 L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichiacoli和ErwiniachrysanthemiL-天 冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有 抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。 L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中 的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可 以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。一些微生物、哺乳动物及植物被证实含 有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有 易培养，成本低等优点，成学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括 Escherichiacoli、Erwiniacarotovora、Erwiniachrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酉先 胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天 冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。 如何在食品安全菌株中表达L-天冬酰胺酶并提高L-天冬酰胺酶分泌能力，是目 前亟待解决的问题。
技术实现思路
为了克服上述问题，以高效分泌信号肽菌株为基础，通过构建p43强启动子菌株， 实现天冬酰胺酶在食品级安全菌株-枯草芽孢杆菌中的高效表达，通过缺失N端残基，进一 步提高天冬酰胺酶的表达强度，实现天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效表达，得到了天冬 酰胺酶分泌能力提高的菌株。 本专利技术的第一个目的是一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，所述突变体的氨 基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。 所述突变体的核苷酸序列是SEQID N0. 2所示的序列。 所述天冬酰胺酶是L-天冬酰胺酶II。 本研究中的突变体为使用了WapA外源信号肽的天冬酰胺酶的基础上做的改造， 也就是在天然的（NCBI上公布的NC-000964. 3)天冬酰胺酶的基础上先替换了信号肽，然后 再次基础上对天冬酰胺酶N端进行的缺失。 本专利技术的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以 PP43NMK质粒为载体，表达含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因。 在本专利技术的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为 宿主构建的。 在本专利技术的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因 的氨基酸序列是SEQIDN0. 1。 在本专利技术的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因 的核苷酸序列是SEQIDN0. 2。 在本专利技术的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因 是连接到PP43NMK质粒的ΚρηI，PstI酶切位点，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行 表达。 本专利技术的第三个目的是提供一种发酵生产天冬酰胺酶的方法，是以所述重组枯草 芽孢杆菌为生产菌株，将种子液按照4 %的接种量转接于发酵培养基中，37°C发酵培养。 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法通过补加酸碱控制pH为7. 0,并控制发酵 液溶氧高于20%，发酵过程中补加蔗糖和蛋白胨进行高密度发酵。 本专利技术还要求保护编码所述突变体的核苷酸序列、表达所述突变体的基因工程 菌。 本专利技术还要求保护所述天冬酰胺酶突变体、所述的重组枯草芽孢杆菌在制备药物 方面的应用。 本专利技术的有益效果： 本专利技术通过对野生天冬酰胺酶的氨基酸序列的N端的进行氨基酸缺失突变，得到 了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，并构建了表达该突变体的重组菌。与野生天冬 酰胺酶相比，本专利技术的突变体的胞外分泌能力提高了 3. 14倍。本专利技术构建的重组菌，发 酵生产天冬酰胺酶酶活达到407. 6U/mL，生产率达到9. 26lV(mL/h)，为目前报道的最高的 产量。其产量是含有野生型信号肽的枯草芽孢杆菌的4. 5倍（Cloning,expression,and characterizationofL-asparaginasefromanewlyisolatedBacillussubtilis B11-06)、重组大肠杆菌的 8. 71 倍（201510102732. 6)。【附图说明】 图1 :突变株发酵酶活； 图 2 :SDS_PAGE分析； 图3:补料分批发酵法WB43H-D30生产L-ASP。【具体实施方式】 培养基： LB培养基：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl10g/L，ρΗ7· 0 ; 发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，尿素lg/L，蔗糖35g/L，磷酸氢二钾 2. 3g/L，磷酸二氢钾L7g/L，硫酸镁 0· 75g/L，氯化钠 5g/L;调节ρΗ6· 8-7. 0。 天冬酰胺酶酶活力的测定： 采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活。1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活 定义：在37°C反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放Ιμπιο?NH3所需要的酶量 为一个酶活单位（U/ml)。酶活测定条件：37°C条件下，lml10mMΚ2ΗΡ04-ΚΗ2Ρ04(ΡΗ7. 5)， 0.lml189mM天冬酰胺，0.lml发酵上清液，保温30分钟，0. 5ml1. 5ΜTCA终止反应。利用 ShimadzuUV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶 活。 实施例1:强启动子高效表达菌株的构建 设计L-ASP的上下游引物Pl、P2(如表1所示），以前期构建的 pMA0911-w当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO.1所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘松，阮洁，冯岳，陈坚，堵国成，蕉蕴，程宏烨，高慧，吕志阳，闫沐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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