本发明专利技术提供一种青霉素酰化酶、编码基因、产生菌株及其应用，属于生物制药技术领域。青霉素酰化酶产生菌，为木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans）PX01，保藏登记号为CCTCC NO：M 2015215。所述霉素酰化酶，具有如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或与该序列具有98%以上同源性的氨基酸序列。所述青霉素酰化酶编码基因具有如SEQ ID NO：1所示的序列或与该序列具有90%以上同源性的序列。本发明专利技术还要求保护含有所述编码基因的重组载体、表达盒或重组菌以及所述酶在合成β-内酰胺类抗生素中的应用。该青霉素酰化酶具有耐高温、pH稳定性好、有机溶剂耐受性强的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术本专利技术属于生物制药
，具体涉及一种青霉素酰化酶、编码基因、产 生菌株及其应用。
技术介绍
青霉素酰化酶（penicillin acylaSe，EC3. 5. 1. 11)又称为青霉素酰胺酶或青霉素 氨基水解酶，是一种N末端亲核丝氨酸水解酶。该酶具有良好的催化酰化/去酰化特性，是 目前为数不多的已被大规模工业化应用的重要酶。 青霉素酰化酶主要应用于抗生素工业中0-内酰胺抗生素中间体6-APA的生产和 半合成内酰胺抗生素的合成。此外，它作为一种生物催化剂，还有其他许多潜在的应 用，比如手性拆分、手性肽的合成、酯类化合物的水解等。因此，青霉素酰化酶是工业上应用 价值很高的酶。SriranganK等（Biotechnologyadvances，2013, 31 (8) : 1319-1332)分析了青霉 素酰化酶的催化机理，在青霉素酰化酶水解青霉素G脱掉6APA后，苯乙酰基-酶中间体会 受到H20分子的亲核进攻，形成苯乙酸。由于整个过程是可逆的，所以在低水活度和pH下， 可以用青霉素G酰化酶催化酰基供体和0-内酰胺母核合成半合成抗生素，在催化体系中 弓丨入有机溶剂可以很好的降低水活度，这就需要酶有良好的有机溶剂耐受性。 尽管青霉素酰化酶的研宄已开展多年并取得重要进展，但基础性的深入研宄和大 规模工业生产应用所必需的优良酶类仍然缺乏，因此筛选有机溶剂耐受性强、表达量高的 酶类对酶法催化半合成内酰胺类抗生素具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种青霉素酰化酶产生菌。 本专利技术的又一目的是提供所述菌产生的青霉素酰化酶，具有耐高温、pH稳定性好、 有机溶剂耐受性强等优点。 本专利技术的再一目的是提供含有所述青霉素酰化酶编码基因的重组载体、表达盒或 重组菌，能够用于高效表达青霉素酰化酶，达6000U/L。 本专利技术的另一目的是提供所述青霉素酰化酶在合成0 _内酰胺类抗生素中的应 用 为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先从南京周边药厂土壤中筛选获得青霉素酰化 酶产生菌，为木糖氧化无色杆菌（Achromobacter xylosoxidans)PX01，其保藏编号为CCTCC NO :M 2015215。该菌所产青霉素酰化酶命名为青霉素酰化酶PGApxOl。 本专利技术分离克隆到AchromobacterxylosoxidansPX01菌株所产青霉素酰化酶 PGApxOl的编码基因，它具有SEQIDN0:1所示的核苷酸序列，为此基因的改造并在各种 外源基因表达系统中高效表达提供了优良的基因材料。经DNA全序列分析，青霉素酰化酶 PGApxOl基因全长2589个核昔酸，编码863个氛基酸，与AchromobacterxylosoxidansA8 产生的青霉素酰化酶编码基因的序列相似性89. 1%，蛋白质一级结构同源性为89. 5%。与 Achromobacter xylosoxidans NH44784-1996青霉素酰化酶基因同源性为83. 3%，蛋白质 一级结构同源性为82. 7%。青霉素酰化酶PGApxOl的氨基酸序列示于SEQ ID N0:2。 本专利技术还要求保护与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且编 码所述青霉素酰化酶的核苷酸序列。 根据本领域人员的公知常识可知，与SEQ ID N0 :2所示氨基酸序列具有98%以上 同源性的氨基酸序列，应当视为与本专利技术保护的青霉素酰化酶PGApxOl等同的同种功能蛋 白质。因此，本专利技术还保护SEQ ID N0 :2所示氨基酸序列经过一个或者多个氨基酸残基的 取代和/或缺失和/或添加后获得的与SEQ ID N0 :2所示氨基酸序列具有98%以上同源 性的氨基酸序列。 本专利技术还要求保护含有所述青霉素酰化酶编码基因的重组载体、表达盒或重组 菌。所述重组菌是将所述基因插入pET-28a后转化大肠杆菌BL21所得。本专利技术构建了青 霉素酰化酶PGApxOl基因及其突变体的重组表达载体，并将重组表达载体成功导入大肠杆 菌表达菌BL21中，加入IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE验证在BL21中成功表达了青霉素酰 化酶PGApxOl及其突变体，经检测，青霉素酰化酶PGApxOl的活力达到6000U/L。 本专利技术对青霉素酰化酶PGApxOl进行了酶学性质的研宄，实验证明青霉素酰化 酶PGApxOl最适反应pH为8. 0,该酶在pH低于6. 5或高于8. 5时，酶活性损失严重，而 在pH6. 5 - 8. 5酶活性较高（80 %以上），同时青霉素酰化酶PGApxOl在pH6. 5 - 8. 5的磷 酸盐缓冲液中处理2h后，都能保持较高的青霉素酰化酶活力，相对酶活性高于92%。青 霉素酰化酶PGApxOl在35-55°C反应时酶活性高于80%，45°C时酶活性最高；青霉素酰化 酶PGApxOl在25°C -45°C保温2h后都能保持较高的青霉素酰化酶活力，相对酶活性高于 96%，但温度高于45°C后，酶活性快速下降。PGApxOl在40%聚乙二醇、丙三醇中，于37°C 处理24h，表现出良好的有机溶剂耐受性，且有一定的激活作用，相对酶活均超过100%， 而在其他有机溶剂中，37°C处理24h后，酶活均低于20%。本专利技术也对突变青霉素酰化酶 PGApxOl进行了酶学性质的研宄，发现与原未突变青霉素酰化酶PGApxOl的酶学性质基本 一致。 本专利技术还要求保护所述青霉素酰化酶在合成0-内酰胺类抗生素中的应用。优 选的技术方案中，所述青霉素酰化酶可以用于合成以6-氨基青霉烷酸为母核或以7-氨基 去乙酰氧基头孢烷酸为母核的内酰胺类抗生素。本专利技术采用青霉素酰化酶PGApxOl 及其突变体催化合成阿莫西林和头孢羟氨苄。所述的酶催化反应分别以6-氨基青霉烷酸 (6-APA)和7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸（7ADCA)为母核，以对应的侧链为酰基供体，在青霉 素酰化酶PGApxOl及其突变体的催化作用下进行缩合反应，分别合成阿莫西林和头孢羟氨 苄，阿莫西林和头孢羟氨苄的合成率分别达到58%和40%。所述的6-APA(或7ADCA)与酰 基供体的摩尔比为1 :1~1 :3,其中6-APA (或7ADCA)的浓度为10~80mmol/L，酰基供体 的浓度为10~240mmol/L。所述的体系为有机溶剂和水组成的混合溶剂，所述有机溶剂选 自丙三醇、聚乙二醇中的任意一种，其体积百分含量为5~80%。所述的酰基供体为羧酸及 其甲酯、酰胺、酸酐等，所述羧酸可以为脂肪酸或芳香酸。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术青霉素酰化酶具有耐高温、pH稳定性好、有机溶 剂耐受性强等优点。在大肠杆菌（E.coli)表达菌BL21中的异源表达，青霉素酰化酶及其 突变体的产量可达6000U/L。该青霉素酰化酶及其突变体成功催化合成0-内酰胺类抗生 素，进一步证明该酶在催化反应中的优良性质，为后续研宄催化合成新型内酰胺类抗 生素奠定了基础。【附图说明】 图1显示了青霉素酰化酶在BL21/pET-pgapx01中的表达情况，其中1-Mark，2-诱 导后BL21/pET裂解液，3、5-诱导后BL21/pET-pgapxO 1裂解液上清，4、6-诱导后BL21/ pET-pgapxOl裂解液沉淀。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
青霉素酰化酶产生菌，其特征在于该菌为木糖氧化无色杆菌(Achromobacter xylosoxidans)PX01，保藏编号为CCTCC NO：M 2015215。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何冰芳，潘鑫，王莉，钦松，吴斌，柏中中，姜天玥，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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