本发明专利技术包括一种长度为２６４６ｂｐ的核苷酸序列，其中从无色杆菌属ＣＣＭ４８２４（古生睾酮丛毛单胞菌子ＣＣＭ ４８２４）中得到的该核苷酸序列具有编码青霉素酰化酶的核苷酸序列的特征，最终该序列片断至少由１５０个核苷酸组成。该序列可用于形成一种ＤＮＡ结构，最后得到的结构至少有一个调控序列来调控基因表达和具有青霉素酰化酶活性的多肽的产生。该序列可以成为一个含有上述结构、启动子、转译启动信号和转译转录终止信号的重组表达载体的一部分。此外，本发明专利技术还涉及一种重组宿主细胞，含有被载体携带或细胞基因组中的核酸，以及一种大肠杆菌菌种ＢＬ２１，它含有质粒ｐＫＸＩＰ１，ｐＫＬＰ３和ｐＫＬＰ６携带的，可以编码青霉素酰化酶的核苷酸序列。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种编码青霉素酰化酶的DNA序列，携带该序列的新型重 组DNA结构及重组微生物。
技术介绍
青霉素酰化酶(E.C.3.5. 1. 11，青霉素酰胺水解酶)是由细菌、放线 菌、真菌和酵母产生的。这些重要的工业酶根据其底物特异性可以分为三 种青霉素G酰化酶(PGA)，青霉素V酰化酶(PVA)和a-氨基酸水解酶 (AEH，也称氨苄青霉素酰化酶)。PGA类酶具有广泛的底物特异性，能催 化青霉素和头孢菌素的氨键水解。PGA的细菌产物属于下述类别中的一种 气单胞菌，无色杆菌，产碱菌，节杆菌，芽孢杆菌，棒状杆菌，大肠杆菌， 欧文氏菌，黄杆菌，克吕沃尔菌，微球菌，诺卡氏菌，变形杆菌，普罗威 登斯菌，假单胞菌，八叠球菌，黄单胞菌，木质部小菌属(Process Biochem. 24:146—154， 1989， Process Biochem. 27:131—143,1992， Biotechnol. Adv. 18:289-301， 2000)除了由变异获得的能表达PGA的高产菌株之外，还可以从大肠杆菌(CS 244 343和CS 246 957)，产碱菌属或粪产碱菌属(Current Microbiology 39:2444-2448, 1999 ;EP 638649， Appl. Environ. Microbiol. 63: 3412-3418: 1997)，粘节杆菌Appl. Environ. Microbiol. 54: 2603-2607， 1988 a 55: 1351-1356， 1989; Gene 143: 79-83,1994)，巨大芽孢杆菌(J. Bacteriol. 93: 302-306， 1967， Appl. Microbiol. Biotechnol. 25: 372-378， 1987; US 3 145 395; Process Biochemistry 29: 263-270,1994)，嗜柠檬酸克 吕沃尔氏菌(Agric. Biol. Chem. 39: 1225-1232， 1975; Gene 49: 69-80， Biotechnol. Letters 14: 285-290， 1992)，雷氏普罗威登斯菌(Acta Biochim. Polonica 28: 275-284， 1981; J. Bacteriol. 168: 431-433,1986; DNA sequences 3: 195-200， 1992)也可以产生具有重组质粒的重组 微生物，其中重组质粒中含有可以编码PGA的结构基因。大多数产PGA的原核生物为革兰氏阴性菌，而酶是在细胞的外周胞质 中。在巨大芽孢杆菌的培养中，酶是从细胞中分泌到培养基中。青霉素G酰化酶在工业上主要用于水解头孢菌素的苯乙酰衍生物，而 青霉素G用于生产中间产物6-APA和7-ADCA。现在，合成反应中也会用 到这些酶，在上述中间产物的酰基化中用来生产半合成抗生素(e.g.， US 5 753 458 and US 5 801 Oil; WO 98/04732; WO 97/04086; Enzyme Microb. Technol. 25: 336—343， 1999; Synthesis of P -lactam antibiotics: Chemistry, Biocatalysis and Process Integration, Ed. : A. Bruggink, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht/Boston/London, 2001)。酶是稳定地固定或封闭形成一种酶催化剂从而使PGA可以在酶催化反 应中反复、长期的使用。这样，酶就能并在反应条件下显现较高的pH稳 定性、温度稳定性和较长的半衰期。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种长度为2646 bp的核苷酸序列，该核苷酸序 列与图5所示的核苷酸序列至少有95%相同。本专利技术的另一个目的是进一步提供本专利技术的核苷酸序列的片断，至少 由150个核苷酸组成的该序列片断用于编码青霉素酰化酶。本专利技术还有一个目的是提供一种含有本专利技术的核苷酸序列或核苷酸 序列片断的核酸结构，它至少具有一个调控序列，用于调控基因表达和多 肽的产生，所述的多肽具有青霉素酰化酶活性。本专利技术的另一个目的是提供一种重组质粒，它含有本专利技术的核苷酸序 列或核苷酸序列片断。本专利技术还有一个目的是提供一种重组表达载体，它含有本专利技术的核酸 结构、启动子、转译启动信号和转译转录终止信号。本专利技术另一个目的是提供一种宿主细胞，它含有本专利技术的核酸结构。 在该宿主细胞中，本专利技术的重组表达载休携带了该核酸结构或该核酸结构被插入到该细胞基因组中。本专利技术还有一个目的是提供重组质粒pKXIPl， pKLP3和沐LP6，它们 是从无色杆菌属菌种中分离出来的，并插入了本专利技术的核苷酸序列，其限 制性内切酶图谱如图1和图2所示。本专利技术还有一个目的是提供一种大肠杆菌菌种BL21,它含有由质粒 pKXIPl， pKLP3和pKLP6携带的本专利技术的序列。本专利技术的基础是长度为2646 bp的核苷酸序列，该核苷酸序列与图5 所示的核苷酸序列相同，然后长度至少为150个碱基的含有该序列的片断 用于编码青霉素酰化酶。所述的序列可以成为DNA结构，重组质粒和载体 的一部分。所述的序列可以通过合适的载体被插入到一个细菌或酵母宿主 的基因组中，这样该细菌或酵母宿主就可以产生青霉素酰化酶了。本专利技术的一个实施例是含有重组质粒PKX1P1的大肠杆菌菌种 BL21(pKXlPl) (CCM 7394)，它是基于最新分离出的，具有青霉素酰化酶 活性的结构基因的核苷酸序列制备的。所述的质粒特征是将长度为2646bp 的DNA片断(含有SD序列的区域)插入到质粒载体pK19 (R. D. Pridmore， Gene 56: 309-312， 1987)中，其限制性内切酶图谱如图1所示。制备该 重组微生物包括将染色体DNA从无色杆菌属菌种CCM 4824 (古生睾酮丛毛 单胞菌子CCM 4824; Plhackova et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 62: 507-516， 2003)中分离出来，然后制备携带了一个5. lkb长的染色体 DNA片断的重组微生物大肠杆菌T0P10(pKLP3)。用质粒pKLP3的DNA，通 过PCR技术(聚合酶链式反应)获得结构基因/^a的核苷酸序列。根据已 测定的基因NT序列，提出了可以测定基因完整核苷酸序列的DNA引物(表 1)，引物包括具有通过了相同的PCR-测序技术的SD序列的调控区。在完 整核苷酸序列的基础上，提出了用于青霉素酰化酶中整个结构基因的PCR 扩增引物(PCR; W. Rychlik: Methods in Molecular Biology 15， 3卜39， 1993)。以无色杆菌属菌种CCM 4824的染色体DNA为模板。分离获得的PCR 产物并插入到多拷贝质粒pK19 (R. D. Pridmore， Gene: 309-312,1987) 中，获得的重组质粒用于宿主菌株大肠杆菌T0P10 (Invitro本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种长度为２６４６ｂｐ的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列与图５所示的核苷酸序列至少有９５％相同。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】CZ 2007-1-31 PV2007-821.一种长度为2646bp的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列与图5所示的核苷酸序列至少有95％相同。2. 如权利要求1所述的核苷酸序列的片断，其特征在于至少由150个核 苷酸组成的该序列片断用于编码青霉素酰化酶。3. —种含有如权利要求1所述的核苷酸序列或如权利要求2所述的核苷 酸序列片断的核酸结构，其特征在于它至少具有一个调控序列，用于调控 基因表达和多肽的产生，所述的多肽具有青霉素酰化酶活性。4. 一种重组质粒，其特征在于它含有如权利要求1所述的核苷酸序列或 如权利要求2所述的核苷酸序列片断。5. —种重组表达载体，其特征在于它含有如...
【专利技术属性】
技术研发人员：P肯斯利克，V斯特帕尼克，L哈罗诺华，S贝卡，WR维亚萨蕊亚妮，D阿奴巴玛，K普拉科瓦，J马萨雷克，
申请(专利权)人：酵素生物技术有限公司，微生物研究所，
类型：发明
国别省市：IN[印度]
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