突变的青霉素扩环酶以及用其制备7-ADCA的方法技术

本发明专利技术提供对青霉素Ｇ具有更高活性的突变的扩环酶（ｅｘｐａｎｄａｓｅ），用于制备苯乙酰－７－氨基去乙酸基头孢菌素酸（ｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｙｌ－７－ａｍｉｎｏｄｅａｃｅｔｏｘｙｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃａｃｉｄ，７－ＡＤＣＡ），该突变的扩环酶具有一个或多个选自Ｍ７３Ｔ、Ｓ７９Ｅ、Ｖ２７５Ｉ、Ｌ２７７Ｋ、Ｃ２８１Ｙ、Ｇ３００Ｖ、Ｎ３０４Ｋ、Ｉ３０５Ｌ和Ｉ３０５Ｍ的氨基酸置换。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对青霉素G具有高底物特异性的突变的青霉素扩环酶(expandase)，表达该突变的扩环酶的重组细胞，以及用该突变的扩环酶制备7-氨基去乙酸基头孢菌素酸(7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，7-ACDA)的方法。已报道一种天然酶，去乙酸基头孢菌素C合酶(deacetoxycephalosporain C synthase，DAOCS，或扩环酶)可能负责扩环反应的催化。链霉菌属(如带小棒链霉菌、生二素链霉菌、教酒链霉菌)可以产生扩环酶。如EP-A-0341892所述，扩环酶可以从带小棒链霉菌获得，而且已经被克隆。对扩环酶的化学和功能性质已经进行了很好的研究，见EP-A-0366354。遗憾的是，天然扩环酶对青霉素G的底物特异性低于对正常底物青霉素N的(Rollins，M.J.等，Can.J.Microbiol.341196-1202(1998)和Crawford，L.等，Bio/Technology，1358-62(1995))。青霉素G可以从商业途径便宜地获得。相反，青霉素N较贵，而且不易获得。另外，即使将青霉素N扩环，其侧链也不能被容易地除去。因此，工业制备中仍然使用7-ADCA的化学合成，而不是酶促合成。有许多申请涉及通过扩环酶生成7-ADCA。USP 5,731,165描述了通过对青霉素G的酶促扩环活性，用表达扩环酶的产黄青霉菌转化体菌株，制备和回收7-ADCA的方法。USP 5,559,005公开了用具有扩环酶活性的，能够接受己二酰-6-氨基-青霉烷酸(己二酰-6-APA)作为底物的转化的产黄青霉菌菌株，制备7-氨基-头孢菌素酸(7-ACA)或7-ADCA的生物方法。然而，因为在体外，己二酰-6-APA和青霉素G都是天然扩环酶的不良底物，因此当在体内应用时，其不太可能具有高扩环效率。最近，Chih H.S.等(Biochemical and BiophysicalResearch Communications，287507-513(2001))公开了一种突变的DAOCS，其包括N304L的氨基酸置换。USP5,919,680描述了一种扩环酶，其具有改变的来自天然扩环酶的氨基酸序列，导致改变的底物特异性。在该专利中，提到了几个氨基酸位点，通过改变一个或多个所提到的氨基酸而产生的突变的扩环酶在青霉素G和青霉素N的混和物中显示更高的青霉素G与青霉素N的活性比，但是其具有低于野生型扩环酶的对青霉素G和青霉素N的单独的活性。因此，仍需要开发对青霉素G具有更高底物特异性和酶促活性的突变的青霉素扩环酶。本专利技术的一个目的是提供突变的青霉素扩环酶，其包括在一个或多个残基位点的氨基酸置换，所述残基位点相应于野生型扩环酶的残基位点，其选自甲硫氨酸73、丝氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304和异亮氨酸305，条件是在天冬酰胺304的残基位点的氨基酸置换不是N304L。具体地说，本专利技术提供突变的青霉素扩环酶，其包括一个或多个选自M73T、S79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L和I305M的特定氨基酸置换，其中氨基酸置换的残基位点相应于野生型的残基位点。本专利技术的另一目的是提供编码突变的青霉素扩环酶的分离的核酸分子。本专利技术的另一目的是提供包含本专利技术的核酸分子和经操作而连接于其的调节序列的重组载体。本专利技术的再一目的是提供包含本专利技术的核酸分子的重组细胞。在另一方面，本专利技术提供产生突变的青霉素扩环酶的方法。在本专利技术的一个实施方案中，该方法包括表达本专利技术的核酸分子，并回收突变的青霉素扩环酶。在本专利技术的另一实施方案中，该方法包括培养本专利技术的重组细胞以表达突变的青霉素扩环酶，并从细胞培养物中回收突变的青霉素扩环酶。在另一方面，本专利技术提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括用突变的青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，接着将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。在再一方面，本专利技术提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G和表达突变的青霉素扩环酶的条件下，培养用本专利技术的核酸分子转化的产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变的扩环酶扩环，并制备苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。从以下的具体实施方式和附图说明将完全理解本专利技术。附图说明图1是本专利技术的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1至9分别是分子量标准参照物和突变型YS5、YS8、YS11、YS12、YS16、YS49、YS53和YS59的纯化的DAOCS。各DAOCS加样量为5μg。图2是本专利技术的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1和2分别代表分子量标准参照物和YS67突变型的纯化的DAOCS。DAOCS的加样量是5μg。图3是本专利技术的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1是分子量标准参照物。泳道2至5代表与本专利技术无关的样品。泳道6和7分别代表SC29和SC39突变型的纯化的DAOCS。DAOCS的加样量是5μg。图4是本专利技术的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1代表分子量标准参照物。泳道2至5代表与本专利技术无关的样品。泳道6至9分别代表YS98、YS108、YS115和YS125的纯化的DAOCS。DAOCS的加样量是5μg。本文中所使用的术语“野生型青霉素扩环酶”指从链霉菌属获得的天然青霉素扩环酶。优选地，该野生型扩环酶从带小棒链霉菌获得。天然青霉素扩环酶及其相应的基因(cefE基因)已在已有技术(例如EP-A-0366354和EP-A-0341892)中很好地表征和描述。本领域技术人员可以从已有技术容易地获得野生型青霉素扩环酶的核酸序列及相应的氨基酸序列。本专利技术的突变的青霉素扩环酶包括其功能等价物。如本文中所用，突变的青霉素扩环酶的“功能等价物”可能包含位于除上述位点之外的位点的其它氨基酸突变(例如缺失、添加或置换)，其中所述其它氨基酸突变导致沉默改变，因此基本上不影响突变的青霉素扩环酶的功能(例如酶活性)。另外，在突变的青霉素扩环酶“功能等价物”中，特定的氨基酸置换(即选自M73T、S79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L和I305M的)可以与类似特征的导致沉默改变的其它氨基酸置换交换。例如，具有“S79D”氨基酸置换的突变的青霉素扩环酶是具有“S79E”氨基酸置换的突变的青霉素扩环酶的功能等价物，因为氨基酸D(天冬氨酸)和E(谷氨酸)都被归类为酸性氨基酸且性质相似。在另一方面，本专利技术提供编码本专利技术的突变的青霉素扩环酶的分离的核酸分子。本专利技术的分离的核酸分子通过使编码野生型青霉素扩环酶的核酸突变而获得。常规突变诱发技术在本领域是公知的，如用γ-射线或紫外线照射，或用诱变剂处理，诱变剂如羟胺和乙基甲烷(ethylmethane)，或定点诱变。本领域技术人员能够选择适宜的突变技术而获得突变的核酸分子。突变的核酸分子可以被进一步克隆并根据它们的生物活性被选择。用来获得本专利技术的分离的核酸分子的更详细的技术，包括诱变、克隆和生物活性筛选，将在以下实施例中描述。根据本专利技术，可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变的青霉素扩环酶，其包括在一个或多个残基位点的氨基酸置换，所述残基位点相应于野生型扩环酶的残基位点，其选自甲硫氨酸７３、丝氨酸７９、缬氨酸２７５、亮氨酸２７７、半胱氨酸２８１、甘氨酸３００、天冬酰胺３０４和异亮氨酸３０５，条件是在天冬酰胺３０４的残基位点的氨基酸置换不是Ｎ３０４Ｌ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨运博，魏佳俐，蔡英杰，许志行，
申请(专利权)人：骏翰生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]