突变的青霉素扩环酶及用其制备7-氨基去乙酰氧基头胞菌素酸的方法技术

本发明专利技术提供对青霉素Ｇ具有更高活性的突变扩环酶（ｅｘｐａｎｄａｓｅ），以用于制备７－氨基去乙酰氧基头胞菌素酸（７－ａｍｉｎｏｄｅａｃｅｔｏｘｙｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒａｎｉｃａｃｉｄ，７－ＡＤＣＡ），该突变的扩环酶包括在一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其系选自甲硫氨酸７３、甘氨酸７９、缬氨酸２７５、亮氨酸２７７、半胱氨酸２８１、甘氨酸３００、天冬酰胺３０４、异亮氨酸３０５、苏氨酸９１、丙氨酸１０６、半胱氨酸１５５、酪氨酸１８４、甲硫氨酸１８８及组氨酸２４４所组成之组，但在天冬酰胺３０４之残基位置不是Ｎ３０４Ｌ以及在半胱氨酸１５５之残基位置为Ｃ１５５Ｙ，且该氨基酸置换至少含有一或多个选自苏氨酸９１、丙氨酸１０６、半胱氨酸１５５、酪氨酸１８４、甲硫氨酸１８８、组氨酸２４４及Ｌ２７７Ｑ所组成之组。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术系关于对青霉素G具有高底物特异性的突变青霉素扩环酶(expandase)，表达该突变扩环酶之重组细胞，以及用该突变扩环酶制备7-氨基去乙酰氧基头胞菌素酸(7-aminodeacetoxycephalosporanicacid，7-ACDA)之方法。已报导一种天然酶，去乙酰氧基头孢菌素C合酶(deacetoxycephalosporain C synthase，DAOCS，或扩环酶)可负责扩环反应的催化。链霉菌属(Streptomyces sp.)，例如，带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)、生二素链霉菌(Streptomycesambofaciens)、教酒链霉菌(Streptomyces chartreusis)，可产生扩环酶。如EP-A-0341892所述，扩环酶可从带小棒链霉菌获得，而且已经被克隆。对扩环酶之化学及功能性质已进行完善研究，参见EP-A-0366354。然而，天然的扩环酶对青霉素G的底物特异性低于对正常底物青霉素N的特异性(Rollins，M.J.等，Can.J.Microbiol.341196-1202(1988)和Maeda，K.等人，Enzyme & MicrobialTechnology，17231-234(1995))。青霉素G可以从商业途径便宜地获得。相反地，青霉素N较贵，而且不易获得。另外，即使将青霉素N扩环，其侧链也无法被容易地除去。因此，工业制备中仍使用7-ADCA的化学合成，而非酶化合成。有许多关于经由扩环酶产生7-ADCA之申请。USP 5,731,165描述经由针对青霉素G之酶化扩环活性，以及使用表达扩环酶之产黄青霉菌(Penicillium chrysogenum)转化体菌株，而制备和回收7-ADCA之方法。USP 5,559,005揭露制备7-氨基-头孢菌素酸(7-ACA)或7-ADCA之生物方法，其系使用具有扩环酶活性而能接受己二酰-6-氨基-青霉烷酸(己二酰-6-APA)作为底物之转化产黄青霉菌菌株。然而，因为己二酰-6-APA及青霉素G都是天然扩环酶在体外的不佳底物，因此当在活体内应用时，天然扩环酶不太可能具有高扩环效率。最近，Chin H.S.等人(Biochemical and Biophysical ResearchCommunications，287507-513(2001))揭露一种突变的DAOCS，其包括N304L的氨基酸置换。USP 5,919,680描述一种突变扩环酶，其具有来自天然扩环酶之经改变的氨基酸序列，导致改变的底物特异性。在该专利中，提到几个氨基酸位置，而该藉由改变一或多个所提氨基酸而产生之突变扩环酶在青霉素G和青霉素N的混合物中显示更高的青霉素G对于青霉素N之活性比例，但是对于青霉素G和青霉素N的单独活性则较野生型扩环酶为低。因此，仍需要开发对青霉素G具有更高底物特异性及酶化活性之突变青霉素扩环酶。本专利技术之目的为提供突变的青霉素扩环酶，其包括一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其系选自甲硫氨酸73、甘氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304、异亮氨酸305、苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188及组氨酸244所组成之群，但在天冬酰胺304的残基位置之氨基酸置换不是N304L以及在半胱氨酸155之残基位置为C155Y，且该氨基酸置换至少含有一或多个选自苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188、组氨酸244及L277Q所组成之群。具体地说，本专利技术提供突变的青霉素扩环酶，其包括一或多个选自M73T、G79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L、I305M、T91A、A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R及L277Q所组成之群之特定氨基酸置换，其中氨基酸置换的残基位置系对应于野生型的残基位置，但该氨基酸置换至少含有一或多个选自T91A、A106T、C155Y、Y184H、M188V、M188I、H244Q、H244R及L277Q所组成之群。更具体而言，本专利技术提供突变的青霉素扩环酶，其包括C155Y、Y184H、V275I及C281Y之氨基酸置换。本专利技术之另一目的为提供编码突变青霉素扩环酶之分离的核酸分子。本专利技术之另一目的为提供包含本专利技术之核酸分子及经操作而连接于其上的调节序列之重组载体。本专利技术之再一目的为提供包含本专利技术的核酸分子之重组细胞。另一方面，本专利技术系提供产生突变青霉素扩环酶之方法。在本专利技术的一个具体实施例中，该方法包括表达本专利技术之核酸分子，并回收突变的青霉素扩环酶。在本专利技术之另一具体实施例中，该方法包括培养本专利技术之重组细胞以表达突变的青霉素扩环酶，并从细胞培养物中回收突变的青霉素扩环酶。在另一方面，本专利技术系提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括用突变的青霉素扩环酶处理青霉素G以制备苯乙酰-7-ADCA，接着将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。在再一方面，本专利技术系提供制备7-ADCA的方法，所述方法包括以下步骤(a)在适于产生青霉素G和表达突变青霉素扩环酶之条件下，培养经本专利技术之核酸分子转化的产青霉素G细胞，以使青霉素G被突变的扩环酶扩环，并制备苯乙酰-7-ADCA；(b)将苯乙酰-7-ADCA去酰化以制备7-ADCA。从以下的具体实施方式和附图说明将完全理解本专利技术。图2是本专利技术的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1和2分别代表分子量标准参照物和YS67突变型之纯化DAOCS。DAOCS加样量是5μg。图3是本专利技术的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1是分子量标准参照物。泳道2至5代表与本专利技术无关的样品。泳道6和7分别代表SC29和SC39突变型之纯化DAOCS。各DAOCS加样量是5μg。图4是本专利技术的纯化的DAOCS的SDS-PAGE结果。泳道1代表分子量标准参照物。泳道2至5代表与本专利技术无关的样品。泳道6至9分别代表YS98、YS108、YS115和YS125的纯化的DAOCS。各DAOCS的加样量是5μg。本专利技术之主要方面为提供突变的青霉素扩环酶，其对青霉素G具有更好的底物特异性，其中该突变青霉素扩环酶包括一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其系选自甲硫氨酸73、甘氨酸79、缬氨酸275、亮氨酸277、半胱氨酸281、甘氨酸300、天冬酰胺304、异亮氨酸305、苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188及组氨酸244所组成之群，但在天冬酰胺304的残基位置的氨基酸置换不是N304L以及在半胱氨酸155之残基位置为C155Y，且该氨基酸置换含有一或多个选自苏氨酸91、丙氨酸106、半胱氨酸155、酪氨酸184、甲硫氨酸188、组氨酸244及L277Q所组成之群。具体而言，本专利技术提供突变的青霉素扩环酶，其包括一或多个选自M73T、G79E、V275I、L277K、C281Y、G300V、N304K、I305L、I305M、T91A、A106T、C155Y、Y184H、M18本文档来自技高网...

【技术保护点】
突变的青霉素扩环酶，其包括在一或多个对应于野生型扩环酶之残基位置的氨基酸置换，其选自甲硫氨酸７３、甘氨酸７９、缬氨酸２７５、亮氨酸２７７、半胱氨酸２８１、甘氨酸３００、天冬酰胺３０４、异亮氨酸３０５、苏氨酸９１、丙氨酸１０６、半胱氨酸１５５、酪氨酸１８４、甲硫氨酸１８８和组氨酸２４４，但在天冬酰胺３０４之残基位置不是Ｎ３０４Ｌ以及在半胱氨酸１５５之残基位置为Ｃ１５５Ｙ，且该氨基酸置换至少含有一或多个选自苏氨酸９１、丙氨酸１０６、半胱氨酸１５５、酪氨酸１８４、甲硫氨酸１８８、组氨酸２４４和Ｌ２７７Ｑ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨运博，魏佳俐，蔡英杰，许志行，
申请(专利权)人：骏瀚生化股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]