使用检测剂、探针和抑制剂检测核酸靶标制造技术

本发明专利技术总体上是关于用于检测特定核酸序列的存在或不存在的方法。本发明专利技术总体上涉及将检测剂并入靶核酸中、向所述反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂、以及检测所述抑制剂对所述寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标，以及包含其的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请为申请日是2011年12月7日、申请号是201180058333.4(PCT/US2011/063654)、专利技术名称为“使用检测剂、探针和抑制剂检测核酸靶标”的中国申请的分案申请。相关申请和以引用的方式并入本申请主张2010年12月7日提交的美国临时专利申请序号61/420,747的优先权。上述申请和其中引用的或在其审查期间引用的所有文献(“申请引用的文献”)和申请引用的文献中引用或参考的所有文献，以及本文引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)，以及本文引用的文献中引用或参考的所有文献，连同本文或任何以引用的方式并入本文的文献中提到的任何产品的任何制造商指导书、说明书、产品说明和产品介绍单均在此以引用的方式并入本文，并且可以在本专利技术的实践中采用。更具体地讲，以引用的方式并入所有参考的文献其程度如同特别地和单独地指出以引用的方式并入每个单独的文献。专利
本专利技术属于生物技术的
更具体地讲，本专利技术属于分子生物学的
联邦基金代号本专利技术部分由国家卫生研究院授予号：1R43HG005144-01资助。联邦政府可以享有本专利技术的某些权利。专利技术背景在分子生物学中的大多数过程中，具备考虑检测特定事件发生的能力的反应是至关重要的。例如，诸如在延伸引物上并入一个或多个核苷酸等事件可能表示存在单核苷酸多态性。在发生某种事件如并入一个或多个核苷酸时，可以将用于检测的机制构建到反应中或(作为替代)在随后的反应中使用，从而提供指示事件发生的方法。单碱基链延伸(借此并入单个二-脱氧核苷酸，它可以含有用于检测的染料(或使用质量作为检测方法))是同时含有用于核酸的询问(interrogation)和检测机制的反应的实例。检测单核苷酸延伸的最简单的方式之一就是荧光，例如，使用荧光标记的核苷酸或FRET(荧光共振能量传递)信号。然而，单碱基链延伸成本高，因为它需要使用荧光标记的核苷酸和/或探针。此外，为了使反应进行，探针和核苷酸两者的浓度必须要高，这就导致高的背景信号。因此，必须采用多个严格的冲洗步骤来除去未杂交或未结合的材料，这对大多数应用来说是不现实的，特别是使用小反应容器时。基于荧光的检测的另一个表现是利用荧光标记分子(荧光团)和淬灭团。如上所述，当用多个分子操作时，荧光分子的浓度就信号而言可能是有问题的。这个问题的一种解决方案是使用双链荧光-淬灭团探针。这些测定往往对诸如探针长度、靶DNA长度或酶反应等特定参数进行优化。大多数荧光团-淬灭团配对测定只在严格的温度控制下对短DNA链或扩增子(<200bp)有效(例如，Holland等，“Detectionofspecificpolymerasechainreactionproductbyutilizingthe5'→3'exonucleaseactivityofThermusaquaticusDNApolymerase”，PNAS(1991)第88卷，7276-7280页；Piatek等，“MolecularbeaconsequenceanalysisfordetectingdrugresistanceinMycobacteriumtuberculosis”,NatBiotechnol(1998)第16卷，第4期，359-363页；Udvardi等，“ElevengoldenrulesofquantitativeRT-PCR”,ThePlantCell(2008)第20卷，1736-1737页；Vet等，“DesignandOptimizationofMolecularBeaconReal-TimePolymeraseChainReactionAssays”，于P.Herdewijn,ed.2004.OligonucleotideSynthesis:MethodsandApplications(MethodsinMolecularBiology,第288卷).NewJersey:HumanaPressInc.,273-290页中；“TopTenPitfallsinQuantitativeReal-timePCRPrimer/ProbeDesignandUse”，AppliedBiosystemsTechNotes(2011)第13卷，第4期，(www.ambion.com/techlib/tn/134/13.html):“PCRPrimerDesignGuidelines”，PREMIERBiosoft(2011)(www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html)。因此，需要一种使用多种核酸探针长度、靶核酸长度、温度条件或DNA聚合酶来检测特定核酸序列的存在或不存在的可靠、有效和划算的方法，这种方法由以下专利技术提供。在本申请中的引用或标识任何文献并不是认可这些文献可以作为本专利技术的先前技术得到。专利技术概述本专利技术总体上是关于用于检测特定核酸序列的存在或不存在的方法。根据本专利技术的一个方法是关于将检测剂并入靶核酸中，向所述反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂，以及检测所述抑制剂对所述寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标。没有干扰表示不存在特定的核酸序列。本专利技术还关于用于检测乳液内的核酸样品中的靶核酸序列的方法。这种方法是关于将检测剂并入靶核酸中，向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂，以及检测抑制剂对寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标，并且其中所述反应在乳液内发生。没有干扰表示不存在特定的核酸序列。本专利技术还关于用于检测微流体装置中的核酸样品中的靶核酸的方法。这种方法是关于将检测剂并入靶核酸中，向反应中添加寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂，以及检测抑制剂对寡核苷酸探针的干扰作为特定靶核酸序列存在的指标，并且其中所述反应在微流体装置内发生。没有干扰表示不存在特定的核酸序列。本专利技术还关于含有用于检测核酸样品中的靶核酸序列的方法的这些试剂的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于并入所述靶核酸中的检测剂、向所述反应中添加的寡核苷酸探针、聚合酶和抑制剂连同用于检测所述抑制剂对所述寡核苷酸探针的干扰(作为存在特定靶核酸序列的指标)的试剂。所述试剂盒可以进一步含有用于执行本专利技术方法的试剂。因此，本专利技术的一个目的是在本专利技术内不涵盖任何先前已知的产品、制造所述产品的工艺或使用所述产品的方法，从而使申请人保留权利并且在此公开任何先前已知的产品、工艺或方法的放弃权利。应进一步指出，本专利技术不希望在本专利技术的范畴内涵盖不符合USP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测靶核酸的方法，其包括：a)将检测剂并入靶核酸中，其中：所述并入包括将所述检测剂连接至所述靶核酸，或所述并入包括使用PCR引物，并且PCR引物包括在3’端的靶标特异性序列和在5’端的通用核酸序列，以及包括荧光团或淬灭团；b)向所述反应中添加寡核苷酸探针；c)向所述反应中添加抑制剂，以使所述抑制剂杂交至并入的检测剂；以及d)如果所述寡核苷酸探针与所述靶核酸杂交，则利用具有链置换能力的聚合酶延伸所述寡核苷酸探针并且从所述检测剂置换所述抑制剂，从而检测作为所述靶核酸存在的指标的所述抑制剂的杂交对所述寡核苷酸探针的干扰,其中所述抑制剂是与所述检测剂杂交的寡核苷酸，所述检测剂是并入所述靶核酸起所述抑制剂结合位点的作用的寡核苷酸。

【技术特征摘要】
2010.12.07 US 61/420,7471.一种用于检测靶核酸的方法，其包括：
a)将检测剂并入靶核酸中，其中：
所述并入包括将所述检测剂连接至所述靶核酸，或
所述并入包括使用PCR引物，并且PCR引物包括在3’端的靶标特异性序列和在5’端的通
用核酸序列，以及包括荧光团或淬灭团；
b)向所述反应中添加寡核苷酸探针；
c)向所述反应中添加抑制剂，以使所述抑制剂杂交至并入的检测剂；以及
d)如果所述寡核苷酸探针与所述靶核酸杂交，则利用具有链置换能力的聚合酶延伸所
述寡核苷酸探针并且从所述检测剂置换所述抑制剂，从而检测作为所述靶核酸存在的指标
的所述抑制剂的杂交对所述寡核苷酸探针的干扰,
其中所述抑制剂是与所述检测剂杂交的寡核苷酸，
所述检测剂是并入所述靶核酸起所述抑制剂结合位点的作用的寡核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸是单链的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述靶核酸内的单核苷酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述靶核酸内的核苷酸的短序列。
5.根据权利要求1所述的方法，其中检测了所述整个靶核酸。
6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·拉兹，P·玛丽，
申请(专利权)人：努拜欧有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US