通过引物延伸进行载玻片上染色制造技术

本发明专利技术提供了一种分析平面样品的方法。在一些情况下，所述方法包括：(a)用与核酸连接的捕获剂标记所述平面样品，其中所述捕获剂与所述平面样品中的互补位点特异性结合；(b)使用荧光显微法，读取通过延伸与所述核酸杂交的引物所导致的荧光信号。本发明专利技术还提供所述方法的若干实施方式以及所述方法的多重变型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】关于联邦资助研究的声明本研究是在政府支持下在国防部授予的合同W81XWH-12-1-0591下以及国家卫生院授予的合同GM104148和HHSN268201000034C下进行。政府享有本专利技术中的某些权利。交叉引用本专利申请主张2014年6月23日申请的美国临时申请序列号62/015,799和2014年12月4日申请的美国非临时申请序列号14/560,921的权益，这些专利申请在此通过引用整体并入。背景目前已有若干主要方法被用于单细胞抗原细胞术。其中最流行的是单细胞PCR、荧光激活流式细胞术、质谱细胞术和单细胞测序。这些(基于荧光和质谱的细胞术)方法受限于无法突破每个分析物(在这种情况下为细胞)100个参数以上的多重水平或无法实现高通量(单细胞测序)。另外，这些方法不适合或者不容易被修改以实现存档组织和基于载玻片的样品的细胞多重分析。本文公开了若干种用于捕获剂检测的相关方法，所述方法是基于用DNA标记捕获剂并且接着通过引物延伸来检测所述DNA。概要提供一种分析平面样品的方法。在一些情况下，所述方法可以包括：(a)用捕获剂(例如抗体或寡核苷酸探针)以产生标记样品的方式标记所述平面样品(例如组织切片)，其中：(i)所述捕获剂与包含第一链和第二链的双链核酸连接；并且(ii)所述第一链或第二链的3’端或5’端可以使用另一链作为模板来延伸；(b)使所述标记样品与i.聚合酶和核苷酸混合物和/或ii.标记寡核苷酸和连接酶接触，从而将一个或多个核苷酸和/或标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的一条链上；以及(c)使用荧光显微法，读取通过将所述一个或多个核苷酸和/或寡核苷酸添加到所述双链核酸的一条链上所产生的荧光信号，从而产生显示所述捕获剂与所述平面样品结合的图案的图像。所述方法可以各种不同方式来实施。例如，在一些实施方案中，步骤(b)可以使标记样品与聚合酶和包含荧光核苷酸的核苷酸混合物接触，从而将所述荧光核苷酸添加到所述双链核酸的一条链(即，顶链或底链，无论哪条链都具有可延伸3’端)上；以及步骤(c)可以包括读取通过将所述荧光核苷酸添加到所述双链核酸的一条链(即，顶链或底链，无论哪条链都具有可延伸3’端)上所产生的荧光信号。在这个实施方案中，所述荧光信号可以：i.从所添加的核苷酸直接发射；ii.由添加到一条链的3’端的两个荧光核苷酸之间的能量转移所产生的FRET信号；或iii.第一添加的荧光核苷酸(即，已添加到一条链上的荧光核苷酸)和第二荧光核苷酸(已存在于一条链中)之间的能量转移所产生的FRET信号。在替代实施方案中，步骤(b)包括使标记样品与连接酶和标记寡核苷酸接触，从而将所述标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的一条链的3’端或5’端；以及步骤(c)包括读取通过将所述标记寡核苷酸连接到所述双链核酸的一条链上所产生的荧光信号。在一些情况下，可延伸3’端可以通过聚合酶来延伸，并且与标记寡核苷酸连接。在这些实施方案中，所述荧光信号可以为：i.从所添加的核苷酸直接发射；ii.由添加到一条链的两个荧光核苷酸之间的能量转移所产生的FRET信号；或iii.添加一条链上的第一荧光核苷酸和已存在于另一链中的第二荧光核苷酸之间的能量转移所产生的FRET信号。在一些实施方案中，一条链的延伸从与另一链杂交并且位于第一链的下游的淬灭荧光标记寡核苷酸移除淬灭剂。在一些实施方案中，第一链为滚环扩增(RCA)产物，以及第二链包含与RCA产物中多个位点杂交的寡核苷酸。在其它实施方案中，第一链为寡核苷酸，以及第二链为与第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。在这些实施方案中，所述寡核苷酸可以经过设计以产生5’突出(overhang)，使得第一链寡核苷酸的3’端可以使用另一寡核苷酸作为模板来延伸。在其它实施方案中，所述寡核苷酸可以经过设计以产生3’突出，使得第一链寡核苷酸的5’端可以使用另一寡核苷酸作为模板来连接。在任一实施方案中，所述平面样品可以为组织切片，例如福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织切片。本文还提供与双链核酸连接的捕获剂，其中：(i)所述双链核酸包含第一链和第二链；(ii)所述捕获剂与第一链连接；以及(iii)第一链或第二链的3’端或5’端可以使用另一链作为模板来延伸。本文还提供捕获剂组合物，其包含多种识别不同互补位点的捕获剂，其中：每种捕获剂与包含第一链和第二链的双链核酸连接；所述捕获剂是通过第一链与双链核酸连接；第一或第二链的3’端或5’端可以使用另一链作为模板来延伸；紧接可延伸末端下游的模板对于每种捕获剂而言是不同的。在这些实施方案中，第一链的序列对于每种捕获剂而言是相同的；而第二链的序列对于每种捕获剂而言是不同的。在使用可逆终止子(“可逆终止子”方法)的实施方案中，与可延伸3’端紧邻的模板可以具有式3’-N4nN1/N2/N3-5’，任选地在5’端后接具有随机核苷酸的短延伸物(例如，1-5个残基)以增加DNA双链体上的总体聚合酶驻留，其中N1、N2、N3和N4是选自G、A、T和C的不同核苷酸并且n是0、1或以上。在一些情况下，所述群体含有核苷酸N1、N2和N3的单核苷酸突出或突出群体包含具有序列3’-N4N1-5’、3’-N4N2-5’和3’-N4N3-5’-5’的双核苷酸突出和任选地具有序列3’-N4N4N1-5’、3’-N4N4N2-5’和3’-N4N4N3-5’的突出等等(例如，具有序列3’-N4N4N4N1-5’、3’-N4N4N4N2-5’和3’-N4N4N4N3-5’的四核苷酸突出)。还提供具有由这些式中任何一个界定的序列的寡核苷酸或RCA产物群体。在RCA实施方案中，可以在RCA产物的每个重复片段中发现所述序列。在这些实施方案中，与可延伸3’端紧邻的模板可以具有更一般式3’-XN1/N2/N3-5’，其中N1、N2、N3是选自G、A、T和C的不同核苷酸并且X为具有随机组成和长度的具有碱基Xi(使得Xi为选自G、A、T和C的不同核苷酸)的核苷酸延伸物。在一些情况下，所述群体可以包含具有序列3’-X1N1-5’、3’-X1N2-5’和3’-X1N3-5’的双核苷酸突出和任选地具有序列3’-N1X1X2-5’、3’-N2X1X2-5’和3’-N3X1X2-5’的突出等等(例如，具有序列3’-N1X1X2X3-5’、3’-N2X1X2X3-5’和3’-N3X1X2X3-5’的四核苷酸突出)。在许多实施方案中，这个群体另外含有核苷酸N1、N2和N3的单核苷酸突出。还提供具有由这些式中任何一个界定的序列的寡核苷酸或RCA产物群体。在RCA实施方案中，可以在RCA产物的每个重复片段中发现所述序列。在依赖“缺失碱基”方法的实施方案中，与可延伸3’端紧邻的模板可以具有式3’-YN1/N2-5’，任选地在5’端后接具有随机核苷酸的短延伸物(例如，1-5个残基)以增加DNA双链体上的总体聚合酶驻留，其中Y是由碱基N3和N4构成的长度为n(n为0、1或以上)的核苷酸序列，其中核苷酸N3是在奇数位置而核苷酸N4是在偶数位置，从突出的起点计数并且N1、N2、N3和N4是选自G、A、T和C的不同核苷酸。例如，在一些情况下，所述群体可以包含具有序列3’-N1-5’和3’-N2-5’或任选地3’-N3N1-5’和3’-N3N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分析平面样品的方法，所述方法包括：(a)用捕获剂标记所述平面样品以产生标记样品，其中：(i)所述捕获剂与包含第一链和第二链的双链核酸连接；并且(ii)所述第一链或所述第二链的3’端或5’端可以使用另一链作为模板来延伸；(b)使所述标记样品与i.聚合酶和多个核苷酸和/或ii.标记寡核苷酸和连接酶接触，从而将所述多个核苷酸中的一个或多个核苷酸和/或标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的一条链的末端上；以及(c)读取通过将所述一个或多个核苷酸和/或标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的所述第一链或所述第二链中的一个上所产生的信号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.23 US 62/015,799;2014.12.04 US 14/560,9211.一种用于分析平面样品的方法，所述方法包括：(a)用捕获剂标记所述平面样品以产生标记样品，其中：(i)所述捕获剂与包含第一链和第二链的双链核酸连接；并且(ii)所述第一链或所述第二链的3’端或5’端可以使用另一链作为模板来延伸；(b)使所述标记样品与i.聚合酶和多个核苷酸和/或ii.标记寡核苷酸和连接酶接触，从而将所述多个核苷酸中的一个或多个核苷酸和/或标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的一条链的末端上；以及(c)读取通过将所述一个或多个核苷酸和/或标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的所述第一链或所述第二链中的一个上所产生的信号。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号是荧光信号。3.根据权利要求2所述的方法，其中读取包括荧光显微法。4.根据任一前述权利要求所述的方法，其进一步包括产生显示所述捕获剂与所述平面样品结合的图案的图像。5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中：步骤(b)包括使所述标记样品与聚合酶和包含荧光核苷酸的多个核苷酸接触，从而将所述荧光核苷酸添加到所述双链核酸的所述第一链或所述第二链中的一个上；以及步骤(c)包括读取通过将所述荧光核苷酸添加到所述双链核酸的所述第一链或所述第二链中的一个上所产生的荧光信号。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述荧光信号是：i.从所添加的核苷酸直接发射；ii.由添加到所述双链核酸的第一链或第二链中的一个上的多个荧光核苷酸中的两个荧光核苷酸之间的能量转移所产生的FRET信号；或iii.由所添加的荧光核苷酸与已存在于第一链或第二链双链核酸中的一个中的第二荧光核苷酸之间的能量转移所产生的FRET信号。7.根据权利要求1到4中任一项所述的方法，其中：步骤(b)包括使所述标记样品与连接酶和标记寡核苷酸接触，从而将所述标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的第一链或第二链中的一个上；以及步骤(c)包括读取通过将所述标记寡核苷酸添加到所述双链核酸的第一链或第二链中的一个上所产生的荧光信号。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述荧光信号是：i.从所添加的标记核苷酸直接发射；ii.由添加到所述双链核酸的第一链或第二链中的一个上的两个标记核苷酸之间的能量转移所产生的FRET信号；或iii.由添加到所述双链核酸的第一链或第二链中的一个上的标记核苷酸与已存在于另一链中的第二荧光核苷酸之间的能量转移所产生的FRET信号。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述标记核苷酸包含荧光核苷酸。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述双链核酸的第一链或第二链中的一个的延伸从与另一链杂交并且位于第一链的下游的淬灭荧光标记寡核苷酸移除淬灭剂。11.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述双链核酸的第一链为滚环扩增(RCA)产物，以及所述双链核酸的第二链包含与所述RCA产物中多个位点杂交的寡核苷酸。12.根据权利要求1到10中任一项所述的方法，其中所述双链核酸的第一链为第一寡核苷酸，以及所述双链核酸的第二链为与所述第一寡核苷酸杂交的第二寡核苷酸。13.根据权利要求1到12中任一项所述的方法，其中所述平面样品为福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)切片。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述捕获剂为抗体、适体或寡核苷酸探针。15.一种捕获剂，其与双链核酸连接，其中：(i)所述双链核酸包含第一链和第二链；(ii)所述捕获剂与所述第一链连接；以及(iii)所述第一链或所述第二链的5’端或3’端可以使用另一链作为模板来延伸。16.一种捕获剂组合物，其包含多种各识别不同互补位点的捕获剂，其中：所述多种捕获剂中的每种与包含第一链和第二链的双链核酸连接；所述第一链或第二链的5’端或3’端可以使用另一链作为模板来延伸；并且紧接所述可延伸末端下游的模板对于所述多种捕获剂中的每种而言是不同的。17.根据权利要求16所述的捕获剂组合物，其中：所述第一链的序列对于所述多种捕获剂中的每种而言是相同的；而所述第二链的序列对于所述多种捕获剂中的每种而言是不同的。18.根据权利要求16所述的组合物，其中与所述可延伸3’端紧邻的模板具有式3’-N...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·萨姆斯科，G·诺兰，Y·戈利采夫，D·R·麦基尔韦恩，
申请(专利权)人：斯坦福大学托管董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US