经由MALDI‑TOF表征微生物制造技术

本发明专利技术涉及一种制备分析板的表征区以通过使用被称为MALDI的基质辅助激光解吸/离子化质谱技术在至少一种抗微生物剂的存在下对至少一种微生物的群体实施至少一种表征的方法。所述方法包括以下连续步骤：‑涉及利用旨在经由MALDI技术表征并包括至少一个具有抗微生物剂的分析区的分析板的步骤；‑将至少一种微生物的群体沉积到所述分析区上与抗微生物剂接触的步骤；‑涉及将分析板在足以允许抗微生物剂与存在的微生物相互作用的条件下保持足够时间的孵育步骤；以及‑在分析区上沉积适用于MALDI技术的基质的步骤。本发明专利技术还涉及表征和功能化方法，并涉及相关的分析板和用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及微生物学领域。更确切地说，本专利技术涉及使用质谱法、特别是基质辅助解吸-离子化和飞行时间(被称为MALDI-TOF)质谱法(MS)表征至少一种微生物的群体。几年来，MALDI-TOF技术已被用于在种的水平上快速鉴定微生物。适用于这种类型的表征的多种形式的仪器已由申请人以及还特别由BrukerDaltonics和Andromas销售。根据微生物体内最为丰富的蛋白质的MALDI-TOF谱，通过与为了鉴定微生物的科、属、以及通常情况下是种的对照数据比较，来鉴定该微生物。通常来说，应用的方案包括在MALDI板上沉积微生物菌落的至少一部分，加入适合于MALDI技术的基质，采集质谱，以及通过与数据库中存储的对照数据比较来鉴定种。最近，MALDI技术还被用于检测微生物对抗生素的耐药性，特别是鉴定由于β-内酰胺型酶(特别是碳青霉烯酶型)的分泌引起的负责水解β-内酰胺型抗生素的表型。就这一点而言，可以提及申请US2012/0196309和WO2012/023845。通过MALDI-TOF表征耐药性涉及在将可能含有能够产生β-内酰胺酶的微生物样品与所述抗生素一起孵育之后，检测β-内酰胺抗生素的本体形式的损失和/或水解形式。虽然在这些专利申请中没有记载待沉积的样品的制备，一般而言，可以想到预先将微生物与抗生素混合，然后将混合物沉积在MALDI板上或者使用微生物的裂解物(参见WO2012/023845，特别是权利要求15)。文献WO2013/113699设想使用质谱法来评价底物对β-内酰胺酶的抑制作用，该评价可能是在细菌的存在下进行的。以下发表文献(Hrabak,Walkovaetal.2011,Hooff,vanKampenetal.2012,Hrabak,Studentovaetal.2012,Sparbier,Schubertetal.2012)更详细地描述了为制备样品而实施的方案，所述方案包括以下步骤：-制备包含微生物的菌落的接种物；-对接种物进行离心；-用抗生素溶液在存在或不存在裂解试剂的情况下再悬浮细菌沉淀；-孵育30分钟至3小时；-离心；以及-将1微升上清液转移到MALDI板上，并加入1微升基质，采用MALDI-TOF质谱法进行分析。因此，在采用MALDI-TOF技术检测耐药性之前制备样品耗时长且乏味。事实上，采用MALDI-TOF技术检测耐药性的程序必须要制备具有高浓度的接种物和/或必须有一个或多个离心步骤。这些步骤需要材料、消耗品和专用设备，并因此消耗了消耗品、时间和操作者的专业知识。此外，考虑到每天进行大量样品的表征是不能想象的，该类型的在先制备使其难以常规使用MALDI-TOF技术来检测耐药性。事实上，在实施采用MALDI-TOF技术鉴定耐药性现象的设备的可用性和必需的制备步骤后获得的样品的可用性之间经常存在着不匹配。另一个问题在于以下事实：用约10μL至50μL体积的抗生素孵育细菌，产生潜在的减少酶-抗生素相互作用的高风险。结果，可能降低酶活性的效力，这将影响检测灵敏度并因此影响技术的稳健性，特别是对于已知产生或分泌少量酶的微生物。检测对抗微生物剂的耐药性还在申请WO2011/045544和US2012/0196309中被描述为能够通过使用其他质谱技术如质谱-质谱(MS-MS)和多反应监测(MRM)进行。在这些情况中，不能对微生物进行质谱法分析和因此的离子化，但这能够对多种纯化操作后获得的蛋白质进行。在本专利技术的上下文中，专利技术人提出了实施一种制备用于采用MALDI技术表征微生物的表征区的新方法，该方法能够用于鉴定对抗生素的耐药性并且易于实施。而且，这一新方法与获得该表征区中存在的样品的多种表征相兼容，多种表征的至少一种对应于鉴定对抗生素的耐药性，而另一种可能对应于鉴定微生物。本专利技术因此提供了一种使用MALDI-TOF技术表征含有至少一种微生物的样品的方法，该方法能够用于在相对短的时间内(大约几小时至1小时，甚至更短)鉴定存在的微生物的群体是否对至少一种抗微生物剂具有耐药性。本专利技术还涉及制备分析板的表征区以便在至少一种抗微生物剂的存在下对至少一种微生物的群体实施至少一种表征的方法，所述表征涉及质谱法分析，其间根据被称为MALDI的基质辅助解吸-离子化质谱技术在通过用激光束轰击分析区对沉积在分析区上的至少一种微生物的群体进行至少一个离子化步骤；制备该分析区的方法的特征在于其包括以下连续步骤：-包括提供用于采用MALDI技术表征的分析板的步骤，该板包括至少一个携带抗微生物剂的分析区；-将至少一种微生物的群体沉积到所述分析区上与抗微生物剂接触的步骤；-孵育步骤，包括使分析板保持在允许抗微生物剂与存在的微生物相互作用的条件下，并持续足够的时间；以及-将适合于MALDI技术的基质沉积到分析区上的步骤。优选地，在根据本专利技术的制备方法的上下文中，沉积待表征的单一微生物的群体。因此，该表征区则可以用于表征单一微生物。根据本专利技术，在没有在先的与抗微生物剂接触的步骤的情况下制备沉积的微生物的群体，即沉积的微生物的群体在被沉积之前不与表征区上存在的抗微生物剂混合。有利地是，根据本专利技术的方法对浓缩、富集和/或纯化步骤后获得的微生物的群体和/或对应于在合适的培养基(特别是凝胶培养基)上生长后获得的菌落或菌落的一部分的微生物的群体进行。举例来说，在本专利技术的上下文中，以诸如使其可以鉴定由β-内酰胺酶(特别是碳青霉烯酶)的产生而引起的耐药性的方式来选择抗微生物剂。抗微生物剂通常是抗生素，优选地选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类，特别是选自氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、哌拉西林、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢西丁、头孢克肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和法罗培南。根据本专利技术的制备方法可以包括功能化步骤，以获得用于采用MALDI技术表征的包括至少一个携带抗微生物剂的分析区(被称为功能化区)的分析板，所述功能化步骤优选地通过沉积抗微生物剂水溶液然后干燥来进行。本专利技术还涉及表征至少一种微生物的群体的方法，所述表征至少包括测定对至少一种抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体存在与否；该方法的特征在于其包括以下连续步骤：-根据本专利技术的制备方法制备分析板的至少一个表征区；-使用被称为MALDI-TOF的基质辅助激光解吸-离子化飞行时间质谱法分析沉积在表征区上的微生物的群体至少一次以便能够推断出该表征区上是否存在对抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体。具体地，用于推断出该表征区上是否存在对抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体的使用MALDI-TOF技术的质谱分析包括验证抗微生物剂和/或抗微生物剂的降解产物的存在。有利地，根据本专利技术的表征方法包括至少两种表征。具体地，表征另外地包括鉴定沉积在表征区上的微生物的群体的科、属或优选地种。优选地，根据本专利技术的表征方法包括：·对应于离子化表征区的第一步骤，通过MALDI型质谱法进行第一分析并对该分析进行第一校准来鉴定沉积在表征区上的微生物的群体的科、属或优选地种；以及·对应于离子化该相同表征区的第二步骤，通过使用MALDI-TOF技术的质谱法进行第二分析并对该分析进行第二校准来测定表征区上存在对抗本文档来自技高网...

【技术保护点】
分析板的表征区的制备方法，所述分析板的表征区用以在至少一种抗微生物剂的存在下对至少一种微生物的群体实施至少一种表征，所述表征包括采用质谱法分析，其间在根据被称为MALDI的基质辅助激光解吸‑离子化质谱技术通过用激光束轰击分析区对沉积在分析区上的至少一种微生物的群体进行至少一个离子化步骤；制备分析区的方法的特征在于其包括以下连续步骤：‑包括提供用于采用MALDI技术表征的分析板的步骤，所述板包括至少一个携带抗微生物剂的分析区；‑将至少一种微生物的群体沉积到所述分析区上与抗微生物剂接触的步骤；‑孵育步骤，包括使分析板保持在允许抗微生物剂与存在的微生物相互作用的条件下，并持续足够的时间；以及‑将适合于MALDI技术的基质沉积到分析区上的步骤。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.30 FR 14573891.分析板的表征区的制备方法，所述分析板的表征区用以在至少一种抗微生物剂的存在下对至少一种微生物的群体实施至少一种表征，所述表征包括采用质谱法分析，其间在根据被称为MALDI的基质辅助激光解吸-离子化质谱技术通过用激光束轰击分析区对沉积在分析区上的至少一种微生物的群体进行至少一个离子化步骤；制备分析区的方法的特征在于其包括以下连续步骤：-包括提供用于采用MALDI技术表征的分析板的步骤，所述板包括至少一个携带抗微生物剂的分析区；-将至少一种微生物的群体沉积到所述分析区上与抗微生物剂接触的步骤；-孵育步骤，包括使分析板保持在允许抗微生物剂与存在的微生物相互作用的条件下，并持续足够的时间；以及-将适合于MALDI技术的基质沉积到分析区上的步骤。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于沉积待表征的单一微生物的群体。3.根据权利要求1或权利要求2所述的制备方法，其特征在于在无预先与抗微生物剂接触的步骤下制备沉积的微生物的群体。4.根据权利要求1至3中任一项所述的制备方法，其特征在于在浓缩、富集和/或纯化的步骤之后获得微生物的群体和/或对应于在合适的培养基，特别是凝胶培养基上生长后获得的菌落或菌落的一部分获得微生物的群体。5.根据权利要求1至4中任一项所述的制备方法，其特征在于以诸如允许鉴定由于β-内酰胺酶，特别是碳青霉烯酶的产生而引起的耐药性的方式选择抗微生物剂。6.根据权利要求1至5中任一项所述的制备方法，其特征在于抗微生物剂是抗生素，优选地选自青霉素类、头孢菌素类、头霉素类、碳青霉烯类、单环β-内酰胺类，特别是选自氨苄西林、阿莫西林、替卡西林、哌拉西林、头孢噻吩、头孢呋辛、头孢西丁、头孢克肟、头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松、头孢泊肟、头孢吡肟、氨曲南、厄他培南、亚胺培南、美罗培南和法罗培南。7.根据权利要求1至6中任一项所述的制备方法，其特征在于所述方法包括功能化步骤，以获得用于通过MALDI技术表征的分析板，所述分析板包括至少一个携带抗微生物剂的分析区，所述功能化步骤优选地通过沉积抗微生物剂的水溶液然后干燥来进行。8.根据权利要求1至7中任一项所述的制备方法，其特征在于功能化的分析区携带单一抗微生物剂。9.至少一种微生物的群体的表征方法，所述表征至少包括测定对至少一种抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体存在与否；所述方法的特征在于其包括以下连续步骤：-根据权利要求1至8中任一项所述的制备方法制备分析板的至少一个表征区；-使用被称为MALDI-TOF的基质辅助激光解吸-离子化飞行时间质谱法分析沉积在表征区上的微生物的群体至少一次，以能够得出表征区上是否存在对抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体。10.根据权利要求9所述的表征方法，其特征在于用于得出表征区上是否存在对抗微生物剂具有耐药性的微生物的群体的使用MALDI-TOF技术的质谱法分析包括验证该抗微生物剂和/或该抗微生物剂的降解产物的存在。11.根据权利要求9或权利要求10所述的表征方法，其特征在于表征另外地包括鉴定沉积在表征区上的微生物的群体的科、属，优选地鉴定该微生物的群体的种。12.根据权利要求9至11中任一项所述的表征方法，其特征在于：·对应于离子化表征区的第一步骤，通过MALDI型质谱法进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·拉姆吉特，J·叙尔，A·费鲁洛，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR