一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法技术

本发明专利技术涉及分子标记鉴定领域，具体公开一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，特定引物组由正向引物L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT，反向引物Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA、Cytb‑R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG组成。利用特定引物组PCR扩增黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的基因组DNA并电泳检测，电泳谱图显示：黑鳃梅童鱼的PCR扩增产物仅在近500 bp处出现一条特异亮带，棘头梅童鱼的PCR扩增产物在近360 bp和近500 bp处各出现一条特异亮带，从而准确、快捷的区分两种幼鱼。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子标记鉴别领域，具体涉及一种利用特定扩增引物组鉴别黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼的方法。
技术介绍
黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼同属石首鱼科下的梅童鱼属，为我国重要的小型经济鱼类。棘头梅童鱼的成年个体一般体长9～14cm、体重15～50g，而黑鳃梅童鱼的成年个体一般体长7.5～9.5cm、体重9～20g，且黑鳃梅童鱼的鳃腔上有深黑色斑块而棘头梅童鱼没有，因此很容易通过外部形态区分黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的成年个体，但是两种梅童鱼在幼鱼阶段的外部形态非常相似，无法通过外部形态进行区分。分子遗传标记可快速、高效和灵敏地检测出基因组DNA的多态性，是当前用于分析水产生物种质鉴别与群体遗传特性的主要标记。利用电泳图谱分析技术，以条带的扩增情况来反映物种的特异遗传信息，操作方法简单、结果分析方便。中国专利CN106086167A，专利名称一种快速鉴定大黄鱼、小黄鱼及棘头梅童鱼的引物序列及方法，公开日期2016年11月9日，公开了一种利用有上游引物和下游引物组成的引物组对提取的基因组DNA进行PCR扩增和电泳检测从而鉴别大黄鱼、小黄鱼和棘头梅童鱼的方法，对应的碱基序列为上游引物：GGAAAGAGCCAGGAAAGC、下游引物：GGCGGAACTCTGAGCAAA，其中小黄鱼在近1000bp处出现特异亮带，大黄鱼在近750bp处出现特异亮带，棘头梅童鱼在低于500bp处出现特异亮带。但是该引物组对同属梅童鱼属的棘头梅童鱼和黑鳃梅童鱼的特异性不明显，PCR扩增后的产物均只在低于500bp处出现特异亮带，因而无法有效鉴别棘头梅童鱼和黑鳃梅童鱼，当然也无法分别两种梅童鱼的幼鱼。
技术实现思路
针对无法通过外部形态区分黑鳃梅童鱼幼鱼与棘头梅童鱼幼鱼，而利用上述专利中所述引物组对基因组DNA扩增也无法准确有效区分两种梅童鱼的幼鱼的问题，本专利技术的目的在于提供一种特定的引物组并利用该特定引物组通过合适的PCR扩增途径鉴别两种梅童鱼的幼鱼的方法。本专利技术提供如下的技术方案：一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，所述特定引物组由一条正向引物L14734和两条反向引物Cytb、Cytb-R组成，对应的碱基序列分别为：L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT；Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA；Cytb-R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG。作为本专利技术的优选，利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法包括以下步骤：（1）利用黑鳃梅童鱼或棘头梅童鱼的幼鱼样品制备样本DNA；（2）对包含样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增；（3）电泳检测PCR扩增后的扩增产物，利用凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。作为本专利技术的优选，通过以下方法判定电泳结果：PCR扩增产物只在近500bp处出现一条特异亮带的为黑鳃梅童鱼幼鱼，PCR扩增产物分别在近360bp和近500bp处各出现一条特异亮带的为棘头梅童鱼幼鱼。作为本专利技术的优选，样本DNA由经苯酚/氯仿抽提法从黑鳃梅童鱼幼鱼或棘头梅童鱼幼鱼的50～100mg的背部肌肉中提取的基因组DNA溶于100(l双蒸水中制得。作为本专利技术的优选，PCR扩增体系的体积为25(l，其组成分别为：10×buffer2.5(L、浓度为2.5mmol/L的dNTP2(L、浓度为10(mol/L的L147341.5(l、浓度为10(mol/L的Cytb1.3(l、浓度为10(mol/L的Cytb-R0.2(l、浓度为5U/(l的Taq酶0.2(l、样本DNA2(l、余量为H2O。作为本专利技术的优选，PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系置于PCR仪中在94℃下保温3min进行预变性，然后经40个温度循环处理，然后72℃下保持10min，其中每个温度循环包括：94℃保持45s、50℃保持45s、72℃保持45s。作为本专利技术的优选，电泳检测条件为：琼脂糖凝胶的质量浓度为1.5%、电泳电压140V、电泳时间20min。本专利技术的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法基于分子生物学原理，根据黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的基因组DNA的序列差异设计三条特异引物：正向引物L14734、反向引物Cytb和反向引物Cytb220，并利用特异引物对黑鳃梅童鱼与棘头梅童鱼的基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物经过凝胶电泳检测得到的电泳谱图显示：黑鳃梅童鱼的PCR扩增产物仅在近500bp处出现一条特异亮带，而棘头梅童鱼的PCR扩增产物在近360bp和近500bp处各出现一条特异亮带，从而准确、简单、快捷的区分两种梅童鱼幼鱼。本专利技术的有益效果如下：本专利技术设计特定引物组对两种梅童鱼幼鱼的样本DNA进行PCR扩增并电泳检测，利用电泳谱图中出现的明显差异可准确的区分黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，也可以准确鉴别成年黑鳃梅童鱼和棘头梅童鱼，具有准确、灵敏、操作简单、快速、高效的优点。附图说明图1是两种梅童鱼的基因组DNA经特定引物组PCR扩增的PCR扩增产物的电泳图谱。图中棘头梅童鱼的PCR扩增产物在近360bp和近500bp处各出现一条特异亮带，黑鳃梅童鱼的PCR扩增产物在近500bp处出现一条特异亮带。具体实施方式下面就本专利技术的具体实施方式作进一步说明。本专利技术中所采用的原料如无特别说明均可从市场上购得或是本领域常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。实施例1一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为棘头梅童鱼幼鱼和黑鳃梅童鱼幼鱼，特定引物组由正向引物L14734和反向引物Cytb、Cytb-R组成，对应序列为：L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT、Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA、Cytb-R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG。一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法优选包括以下步骤：（1）提取基因组DNA：利用黑鳃梅童鱼或棘头梅童鱼的幼鱼样品制备样本DNA，优选取幼鱼样品的背部肌肉50～100mg经苯酚/氯仿提取法提取基因组DNA，并将提取后的基因组DNA溶于100(l双蒸水中制得样本DNA。（2）PCR扩增：将包含样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系置于PCR仪中进行PCR扩增，制取样本DNA的PCR扩增产物，其中PCR扩增体系的体积为25(l，组成优选为：10×buffer2.5(L、浓度为2.5mmol/L的dNTP2(L、浓度为10(mol/L的L147341.5(l、浓度为10(mol/L的Cytb1.3(l、浓度为10(mol/L的Cytb-R0.2(l、浓度为5U/(l的Taq酶0.2(l、样本DNA2(l、余量为H2O。PCR扩增的反应条件为：将PCR扩增体系在94℃下保温3min进行预变性，然后经过40个温度循环处理，然后72℃下保持10min，每个温度循环依次包括：94℃保持45s、50℃保持45s、72℃保持45s。（3）电泳检测：将PCR扩增产物置于琼脂糖凝胶质量浓度为1.5%的TBE溶液中进行电泳试验，电泳电压为140V，电泳时间为20min。利用凝胶成像系统对电泳结果拍照、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，其特征在于，所述特定引物组由一条正向引物L14734和两条反向引物Cytb、Cytb‑R组成，对应的碱基序列分别为：L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT；Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA；Cytb‑R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG。

【技术特征摘要】
1.一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，两种梅童鱼幼鱼分别为黑鳃梅童鱼幼鱼和棘头梅童鱼幼鱼，其特征在于，所述特定引物组由一条正向引物L14734和两条反向引物Cytb、Cytb-R组成，对应的碱基序列分别为：L14734：AACCACCGTTGTTATTCAACT；Cytb：CTCAGAATGACATTTGTCCTCA；Cytb-R：GTTGCGGCCGCGACAATAAAG。2.根据权利要求1所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，包括以下步骤：（1）利用黑鳃梅童鱼幼鱼或棘头梅童鱼幼鱼制备样本DNA；（2）对包含有样本DNA和特定引物组的PCR扩增体系进行PCR扩增；（3）电泳检测PCR扩增后的扩增产物，利用凝胶成像系统拍照、记录，对电泳结果判定。3.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，其特征在于，通过以下方法判定电泳结果：PCR扩增产物只在近500bp处出现一条特异亮带的为黑鳃梅童鱼幼鱼，PCR扩增产物分别在近360bp和近500bp处各出现一条特异亮带的为棘头梅童鱼幼鱼。4.根据权利要求2所述的一种利用特定引物组鉴别两种梅童鱼幼鱼的方法，其特征在于，样...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩志强，王秀亮，高天翔，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33