一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的方法技术

本发明专利技术提供了一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒及其构建方法和应用、一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株及其构建方法和应用、以及一种生产谷胱甘肽的方法。本发明专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒包括ＧＳＨ１和ＧＳＨ２序列和一合适的载体片段；本发明专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系重组菌株使用谷胱甘肽合成酶系重组质粒构建；本发明专利技术提供的生产谷胱甘肽的方法为发酵本发明专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系重组菌株。使用本发明专利技术提供的共表达质粒可以构建产谷胱甘肽毕赤酵母，获得的产谷胱甘肽毕赤酵母发酵培养，获得的发酵液中谷胱甘肽产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平，提高了原料利用率、降低了生产成本和能耗，可用于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体地说，是关于一种用代谢工程菌生产谷胱甘肽的 方法。
技术介绍
谷胱甘肽，即Y-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸，简称GSH，由前体物质L-谷氨酸、 L-半胱氨酸和甘氨酸经Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSH1)和谷胱甘肽合成酶(GSH2) 催化合成，能有效清除掉人体内的自由基，净化人体内的环境污染，增进人体健康。GSH 在医药领域、食品领域和化妆品等方面均有广泛的用途。谷胱甘肽的工业生产主要有萃取法、化学合成法、发酵法和酶法。谷胱甘肽的早期生 产都采用萃取法，原料多为酵母，这是生产谷胱甘肽的经典方法，也是发酵法生产流程中 的下游过程基础。化学合成法生产工艺已较成熟，但化学合成的谷胱甘肽是消旋体，需要 进行光学拆分，且工艺过程存在成本高、操作复杂和环境污染等问题。酶法由于原料较贵， 目前还不适于工业化生产。由于工艺及方法得到不断改进，发酵法目前已经成为生产谷胱 甘肽最普遍的方法，其中以诱变处理获得高谷胱甘肽含量的酵母变异菌株来生产谷胱甘肽 最为常见。Nomum等通过对酿酒酵母的诱变和筛选得到了一株高产谷胱甘肽的菌种酿酒 酵母K-2，发酵产量达到了 2.7g/L。 Ishii等报道(1989, JP1141591)采用合成培养基发酵 酿酒酵母，谷胱甘肽的产量达到了 4.32g/L，这是目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水 平。但利用酵母菌培养来单独生产谷胱甘肽，存在原料利用率低、成本和能耗高等问题， 特别是谷胱甘肽的产量低而生产成本高的问题，因此，有必要对其加以改进，以克服上述 缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒，以用于构建表达谷胱甘肽 合成酶系的菌株。本专利技术还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法。本专利技术还有一个目的在于，提供一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒的应用。 本专利技术还有一个目的在于，提供一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株。 本专利技术还有一个目的在于，提供一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株的构建方法。 本专利技术还有一个目的在于，提供一种表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株的应用。 本专利技术还有一个目的在于，提供一种生产谷胱甘肽的方法。本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒包括GSH1和GSH2序列和一合适的载体片 段；所述GSH1和GSH2序列分别如Genebank上编号为EF633694、 EF633695的序列所 示。根据本专利技术的一个优选实施例，在谷胱甘肽合成酶系重组质粒中，GSH1和GSH2编 码区分别置于GAP启动子下。根据本专利技术的另一个优选实施例，所述谷胱甘肽合成酶系重组质粒还包括一段与宿主 菌基因组同源的片段，以用于提高整合效率。本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒的构建方法包括以下步骤A) PCR扩增获 得GSH1、 GSH2序歹U; B)将GSH1、 GSH2序列共同克隆入合适的表达载体。本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系重组质粒可用于构建表达谷胱甘肽合成酶系的菌株。本专利技术提供的表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株，使用本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶 系重组质粒构建。本专利技术提供的表达谷胱甘肽合成酶系的重组菌株的构建方法包括将谷胱甘肽合成酶 系重组质粒转化到宿主菌的步骤。本专利技术提供的重组菌株可用于生产谷胱甘肽。本专利技术提供的生产谷胱甘肽的方法通过发酵培养本专利技术提供的谷胱甘肽合成酶系重 组菌株，生产获得谷胱甘肽。根据本专利技术的一个优选实施例，表达谷胱甘肽的重组菌株为毕赤酵母GS115。 使用本专利技术提供的共表达质粒可以构建产谷胱甘肽毕赤酵母，获得的产谷胱甘肽联产 毕赤酵母发酵培养，获得的发酵液中谷胱甘肽产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产 的最高水平，提高了原料利用率、降低了生产成本和能耗，可用于工业化生产。附图说明图1是PCR扩增获得的GSH1和GSH2的检测结果，其中，泳道1为GSH1，泳道2 为GSH2。图2是pGKGlG2的结构示意图。图3是质粒HZ109的凝胶电泳检测结果，其中，泳道1为使用GSH2的特异性引物 GAP-50和GSH2R500进行PCR扩增获得的结果，泳道2为使用GSH1的特异性引物 GAP-50和GSH1R650进行PCR扩增获得的结果。本专利技术构建获得的产谷胱甘肽基因工程菌株HZ109已于2008年6月23日提交位于 武汉的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏号为CCTCCM 208096。具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验 室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的条件或厂商提 供的方案进行。在本专利技术的下述实施例中，使用的胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。 在本专利技术的下述实施例中，使用的pMD18-T载体购自Takara; pPIC3.5K和pGAPZB 质粒购自Invitrogen。在本专利技术的下述实施例中，使用的T4 DNA连接酶购自Takara; KOD DNA聚合酶购 自Toyobo; TaqDNA聚合酶购自Fermentas;限制性内切酶BamHI， BglII， EcoRV， Smal， Kpn2I等均购自Fermentas 。在本专利技术的下述实施例中，使用的酿酒酵母BY4742获取自EUROSCARF;大肠杆菌 DH5a购自Takara;毕赤酵母宿主菌GS115购自Invitrogen,其基因型是his4，表现为组氨 酸缺陷菌株，不能在无组氨酸的MD平板上生长。在本专利技术的下述实施例中，使用的YPD培养基的配方为1%酵母提取物，2%蛋白 胨，2%葡萄糖；使用的BMGY培养基的配方为1%酵母提取物，2%蛋白胨，lOOmM 磷酸钾缓冲液(pH6.0)， 1.34%酵母氮源，4Xl(rSX生物素，1%甘油；MD培养基的配方 为1.34%酵母氮源，4X10-s^生物素，1%葡萄糖。配置固体平板培养基时，按照上述 配方添加2%琼脂。在本专利技术的下述实施例中，感受态细胞的制备和转化，均按照Invitrogen公司尸/c/z/" Expression Kit手册中提供的方法进行，其中，电转杯为0.2mm，电转化仪使用bio-rad的 Micropulser型电转化仪，电转化参数为SC2 (1.5kV)。5在本专利技术的下述实施例中，GSH产量的检测参照王春、严伟民，注射用还原型谷胱甘肽质量标准分析方法~""HPLC法的建立与验证，中国临床药学杂志2005年第14 巻第3期。实施例1、共表达质粒的构建1.1、 引物设计根据Genebank报道的GSHl、 GSH2序歹U，设计以下4条引物 GSH1 UP: ATCGATACGATGGGACTCTTAGCTTTGGG; GSH1DNM: CAATTGTTAACATTTGCTTTCTATTG; GSH2UP: TTCGAAACGATGGCACACTATCCACCTTC; GSH2DNE: GAATTCCTAGTAAAGAATAATACTGTC 。其中，GSH1UP和GSH1DNM用于扩增GSH1编码区；GSH2UP和G本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷胱甘肽合成酶系重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括ＧＳＨ１和ＧＳＨ２序列和一合适的载体片段，所述ＧＳＨ１和ＧＳＨ２序列分别如Ｇｅｎｅｂａｎｋ上编号为ＥＦ６３３６９４、ＥＦ６３３６９５的序列所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晟，杨俊杰，陶荣盛，曹传增，范文超，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，中国科学院上海生命科学研究院湖州工业生物技术中心，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]