一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法技术

本发明专利技术提供了一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：采集被测者口腔粘膜样本，抽提基因组ＤＮＡ，基因分型和结果分析。本发明专利技术所需检测的ＤＮＡ可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的ＤＮＡ抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细胞的ＤＮＡ抽提并进行ＤＮＡ浓度和纯度的测定。本发明专利技术３个位点的基因分型分别采用ＰＣＲ技术、凝胶电泳技术以及ＴａｑＭａｎ－ＭＧＢ技术进行分型。经实验验证，基因分型的准确率达到了９９％以上，重复性达到了１００％。

Glutathione transferase genotype detection method

The invention provides a glutathione S-transferase gene type detection method, which is characterized in that the following steps: collecting the subjects of oral mucosa samples, extracting genomic DNA analysis and genotyping results. The DNA detected by the invention can be extracted by oral mucosa epithelial cells. Samples were collected by oral mucosal epithelial cell sampling methods and equipment. DNA extraction of samples, DNA extraction of oral epithelial cells by silica gel adsorption method, and determination of DNA concentration and purity. The genotyping of the 3 loci of the invention is carried out by PCR technique, gel electrophoresis technique and TaqMan MGB technique respectively. The experiment proved that the accuracy of genotyping was over 99%, and the repeatability was 100%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，用于检测谷胱甘肽硫转移酶 类家族MU类(GSTM1基因)缺失、THETA类(GSTT1基因)缺失和PI类(GSTP1)的变异，属 于分子生物学

技术介绍
外源性化学物质包括治疗性药物、环境或职业密切接触的物质等。机体对外来化 合物的代谢过程包括I相反应和II相反应，I相反应主要对外来化合物进行生物转化，如 氧化、还原、水解反应。II相反应则对I相反应代谢活化后所产生的中间代谢产物与体内的 化合物进行结合反应，如谷胱甘肽结合、葡糖醛酸化等反应。 一般讲外来化合物经机体代 谢后毒性降低或丧失，但亦有少数外来化合物经机体代谢后毒性增高，对人体产生危害。 谷胱甘肽硫转移酶类家族GST在机体内行使功能和参与反应的途径是参与谷胱 甘肽代谢通路。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸构成的三肽物质，并带有活性的巯 基，主要存在于细胞液内，在机体和细胞内行使多种生化作用，具有重要的意义。谷胱甘肽 的一个主要作用，是通过谷胱甘肽硫转移酶类家族的作用，使谷胱甘肽的半胱氨酸残基上 具有很强亲核力的巯基基团，去与亲电子的靶物质结合。通过谷胱甘肽和化学物质或其代 谢反应产物结合，可以降低这些物质的毒性，从而使细胞免受损害。 谷胱甘肽所结合的亲电子物质包括很多种，如致癌物质、药物、环境毒素、氧化链 产物等等。常见的药物结合底物包括水杨酸盐、扑热息痛、抗痨药、利尿酸、苯巴比妥、有机 磷农药、抗肿瘤药物等。当谷胱甘肽与多种氧化链代谢产物反应后，产生的减毒结合物可使 其易于进入下一步代谢，并最后以硫醇尿酸的形式排泄出体外。 大样本量中国人群研究证实，谷胱甘肽硫转移酶类家族MU类(GSTM1基因)缺失、 THETA类(GSTT1基因)缺失和PI类(GSTP1)变异在中国人群众普遍存在(GSTM1缺失64X、 GSTT1缺失55%、 GSTP1 11el05Val变异29% )与谷胱甘肽硫转移酶活性以及多种毒物、 药物的代谢显著相关。以往的检测方法在对GSTM1和GSTT1的大片段缺失进行检测时出现 的假阳性现象无法很好的排查和解释，本专利技术中增加了一对内参因物的设计避免了这一现 象，同时适用于大样本量的谷胱甘肽硫转移酶基因分型检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种准确率高的谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法。 为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是提供一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为 步骤1.检测的样品类型与采样方法 用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本； 步骤2.基因组DNA的抽提方法 采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小时一 2. 5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测； 步骤3.基因分型 采用PCR技术、凝胶电泳技术以及荧光定量PCR技术对谷胱甘肽硫转移酶类家族 MU类GSTM1基因、THETA类GSTT1基因和PI类GSTPl基因位点进行分型 步骤3-1 ， PCR反应体系 将每一个被测者样本放入1个反应孔，加入PCR标准反应体系，同时检测GSTM1和GSTT1基因，Albumin基因作为阳性对照，标准反应体系的引物浓度为10uM，反应体系总体积为20ul，由PCR试剂5ul，GSTMl基因、GSTTl基因和Albumin基因的正反向引物各0. 4ul，20ng/ ii 1的步骤2得到的DNA模板3 y 1和去离子水9. 6ul组成；GSTM1基因正向和反向引物 正向引物GAACTCCCTGAAAAGCTAAGC 反向引物GTTGGGCTCAAATATACGGTGG GSTT1基因正向和反向引物 正向引物TTCCTTACTGGTCCTCACATCTC 反向引物TCACCGGATCATGGCCAGCA Albumin基因正向和反向引物 正向引物GCCCTCTGCTAACAAGTCCTAC 反向引物GCCCTAAAAAGAAAATCCCCAATC 步骤3-2， PCR反应条件 将反应孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为95。C预热15分钟；再 进行35个循环的95°C、45秒；60。C、45秒；72。C、60秒；72。C、7分钟后，降温至4°C ; 步骤3-3，将反应孔在PCR扩增仪反应后的产物进行电泳检测 a. 1 %琼脂糖凝胶插小号孔梳子； b. 2000bpDNA标记物6ul ; c.步骤3-2的PCR产物10ul加入电泳缓冲液lul ; d.电泳电压:120v ; e.电泳时间20min拍摄一张电泳图；30min拍摄一张电泳图；GSTM1基因目的条 带为219bp ;GSTT1基因目的条带为480bp ;Alb咖in基因目的条带为350bp ; 步骤3-4，荧光定量PCR反应 将每一个被测者样本放入1个反应孔，检测GSTPl rsl695位点基因多态性，并增 设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔； 在每一个反应孔中加入试剂为荧光定量PCR反应体系，总体积为10 iU，即浓度为 20ng/iil的DNA模板2iU、10X荧光定量PCR反应缓冲液1 iil、25mM合成DNA的四种脱氧 核苷酸底物dNTP 0. liil、25mM氯化镁溶液0. 5iU、Taq DNA聚合酶0. 02 iU、20 y M的正向 引物和反向引物各0. 5 ill 、 10 ii M的带VIC荧光A型探针和带FAM荧光G型探针各0. 25 和去离子水4. 88 ill ; 其中，带FAM荧光G型探针序列为TGCAAATACaTCTCCC，带FAM荧光G型探针序 列为TGCAAATACgTCTCCC, GSTPl基因正向引物为CCTGGTGGACATGGTGAATGAC,反向引物为 CCGCCTCATAGTTGGTGTAGATG ; 将反应孔和空白对照孔在ABI9700型PCR扩增仪上进行反应，先进行预热5(TC、 2分钟，95°C 、 10分钟，然后再进行60个循环的95°C 、30秒，60°C 、 1分钟，反应结束，取出后 再放入ABI7900型荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到在谷胱甘肽硫转移酶Plrsl695 图； 步骤4 :数据读取 在步骤3-3中得到的电泳图中，观察GSTM1基因以及GSTM1基因是否缺失； 将步骤3-4得到的谷胱甘肽硫转移酶Plrs1695图与NTC空白对照进行比较，存在 纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同 的基因型，即AA基因型、AG基因型和GG基因型；若检测结果点位于坐标轴左上区域，则为 GG基因型，若检测结果点位于坐标轴右上区域，则为AG基因型，若检测结果点位于坐标轴 右下区域，则为AA基因型；若为GG基因型，谷胱甘肽硫转移酶活性低。 本专利技术所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜 上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细 胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本专利技术3个位点的基因分型分别采用PCR技 术、凝胶电泳技术以及TaqMan^MGB技术进行分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达 到了 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种谷胱甘肽硫转移酶基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为：　　步骤１．检测的样品类型与采样方法：　　用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各２０次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；　　步骤２．基因组ＤＮＡ的抽提方法：　　采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组ＤＮＡ，时间为２小时－２．５小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；　　步骤３．基因分型：　　采用ＰＣＲ技术、凝胶电泳技术以及荧光定量ＰＣＲ技术对谷胱甘肽硫转移酶类家族ＭＵ类ＧＳＴＭ１基因、ＴＨＥＴ、Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．０２μｌ、２０μＭ的正向引物和反向引物各０．５μｌ、１０μＭ的带ＶＩＣ荧光Ａ型探针和带ＦＡＭ荧光Ｇ型探针各０．２５μｌ和去离子水４．８８μｌ；　　其中，带ＦＡＭ荧光Ｇ型探针序列为ＴＧＣＡＡＡＴＡＣａＴＣＴＣＣＣ，带ＦＡＭ荧光Ｇ型探针序列为ＴＧＣＡＡＡＴＡＣｇＴＣＴＣＣＣ，ＧＳＴＰ１基因正向引物为ＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＧＡＣ，反向引物为ＣＣＧＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＧＧＴＧＴＡＧＡＴＧ；　　将反应孔和空白对照孔在ＡＢＩ９７００型ＰＣＲ扩增仪上进行反应，先进行预热：５０℃、２分钟，９５℃、１０分钟，然后再进行６０个循环的９５℃、３０秒，６０℃、１分钟，反应结束，取出后再放入ＡＢＩ７９００型荧光定量ＰＣＲ仪上读取样品荧光量，得到在谷胱甘肽硫转移酶Ｐ１ｒｓ１６９５图；　　步骤４：数据读取：　　在步骤３－３中得到的电泳图中，观察ＧＳＴＭ１基因以及ＧＳＴＭ１基因是否缺失；若存在ＧＳＴＭ１基因缺失或ＧＳＴＭ１基因缺失，谷胱甘肽硫转移酶活性低；　　将步骤３－４得到的谷胱甘肽硫转移酶Ｐ１　ｒｓ１６９５图与ＮＴＣ空白对照进行比较，存在纯ＶＩＣ荧光信号、ＶＩＣ和ＦＡＭ杂合荧光信号以及纯ＦＡＭ荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型，即ＡＡ基因型、ＡＧ基因型和ＧＧ基因型；若检测结果点位于坐标轴左上区域，则为ＧＧ基因型，若检测结果点位于坐标轴右上区域，则为ＡＧ基因型，若检测结果点位于坐标轴右下区域，则为ＡＡ基因型；若为ＧＧ基因型，谷胱甘肽硫转移酶活性低。Ａ类ＧＳＴＴ１基因和ＰＩ类ＧＳＴＰ１基因位点进行分型：　　步骤３－１，ＰＣＲ反应体系：　　将每一个被测者样本放入１个反应孔，加入ＰＣＲ标准反应体系，同时检测ＧＳＴＭ１和ＧＳＴＴ１基因，Ａｌｂｕｍｉｎ基因作为阳性对照，标准反应体系的引物浓度为１０ｕＭ，反应体系总体积为２０ｕｌ，由Ｐ...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛丹丹，傅咏南，
申请(专利权)人：上海中优医药高科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[]