本发明专利技术涉及可用于医学、特别是癌症化疗的预测方法。本发明专利技术的目的是提供一种用于评价固定或固定及石蜡包埋组织中的ＧＳＴ－π表达水平的方法，并且通过检查患者肿瘤细胞中ＧＳＴ－πｍＲＮＡ含量并将其与预定阈值表达水平进行比较，预测患者肿瘤对用基于铂的疗法的可能抗性或敏感性。更准确地讲，本发明专利技术提供寡核苷酸引物对ＧＳＴ－π和包括其用于检测ＧＳＴ－πｍＲＮＡ水平的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及可用于医学、特别是癌症化疗的预测方法。更准确地讲，本专利技术涉及对患者肿瘤细胞基因表达的评价。通过检查人类参与DNA修复的基因所表达的mRNA，分析肿瘤细胞对靶向DNA的化疗药、尤其是以铂类药物的方式损伤DNA的药物的抗性。
技术介绍
当正常细胞经历致瘤性转化并变成恶性细胞时，引起癌症。转化(恶性)细胞逃避特化细胞表型和抑制细胞增殖的正常生理控制。个体中的转化细胞如此增殖，形成肿瘤。当肿瘤被发现时，临床目标是在经过治疗的个体中选择性地消灭恶性细胞，同时减轻对正常细胞所造成的任何损害。化学疗法基于应用对癌细胞有选择性毒性(细胞毒性)的药物。已开发出几个大类的化疗药，包括干扰核酸合成、蛋白质合成和其它生命代谢过程的药物。这些药物统称为抗代谢药。其它类的化疗药对细胞DNA造成损伤。这些种类的药物统称为基因毒物。然而，常常只有在治疗的试验期后，才可以对个体肿瘤对所需化疗药或联合药物的敏感性进行准确评价。不成功试验期中所用去的时间对在攻击性恶性肿瘤的临床处理造成相当大的危险。对细胞DNA损伤的修复是一个由细胞酶促DNA修复机制进行的一个重要的生物学过程。细胞基因组中未修复的损伤妨碍DNA复制、削弱新合成DNA的复制保真度和/或阻碍细胞存活所需的基因表达。因此，基因毒性药物一般认为对进入DNA合成的活跃的分裂细胞比对休眠的非分裂细胞的毒性更大。许多机体组织的正常细胞是休眠细胞且通常不再进入细胞周期和分裂。一般而言，细胞分裂期之间的较长时间，给受化疗基因毒素影响的正常细胞的DNA损伤修复提供了时间。结果，达到对杀伤癌细胞的一定选择性。通过共同给予属于这些大类的两种或两种以上的化疗药，许多治疗方案反映出试图改进对癌细胞的选择性。因为实体瘤中有效的化学疗法通常需要联合药物，对各单一药物的抗性或敏感性的决定因子的鉴定或定量已变成用以设计各种联合化疗的重要工具。已经表明两种广泛使用的损伤细胞DNA的基因毒性抗癌药是顺铂(DDP)和卡铂。顺铂和/或卡铂目前选择性用于治疗上皮和间充质来源的不同肿瘤，包括呼吸道、胃肠道和生殖道的癌症或肉瘤，此外这两种药还用于中枢神经系统以及头颈部鳞状细胞来源的不同肿瘤。对于睾丸癌的治疗，目前优选顺铂与其它药物联合使用，并且在许多情况下，产生持续缓解。(Loehrer等，1984，100 Ann.Int.Med.704)。顺铂(DDP)通过形成链内加合物而破坏DNA结构。对铂类药物例如DDP的抗性归因于对铂加合物的耐受性增强、药物累积减少或DNA修复增加。虽然对DDP的抗性是多种多样的，但是DNA修复机制的改变可能起重要的作用。谷胱甘肽-S-转移酶(GST)蛋白家族参与细胞毒性药物的解毒作用。通过催化毒性和致癌亲电分子与谷胱甘肽的缀合，所述GST酶保护细胞大分子免遭损伤(Boyer等，Preparation，characterization andproperties of glutathione S-transferases(谷胱甘肽S-转移酶的制备、表征和特性)。载于Zakim D，Vessey D(编著)Biochemical Pharmacologyand Toxicology.New York，NYJohn Wiley and Sons，1985.)。这些蛋白的一种确定的异构类型谷胱甘肽S-转移酶Pi(GST-Pi，在本文也称为GSTP1或GST-π，并可互换使用)在人上皮组织中广泛表达，并且已经证明在数种肿瘤中过量表达(Terrier等，Am J Pathol 1990；137845-853；Moscow等，Cancer Res 1989；491422-1428)。已经发现，GST-π水平在抗药性肿瘤中增加，虽然确切机制仍不清楚(Tsuchida等，CritRev Biochem Mol Biol 1992；27337-384)。以前的研究已经表明，GST蛋白(不是mRNA)的低表达与对基于铂的化疗的反应相关(Nishimura等，Cancer.Clin Cancer Res 1996；21859-1865；Tominaga等，Am.J.Gastro.941664-1668，1999；Kase等，Acta Cytologia.421397-1402，1998)。然而，这些研究并没有定量测量基因表达，而是使用半定量免疫组织化学染色法测量蛋白质水平。然而，需要GST-π基因表达的定量测量，以实现非常有效的预测。对大多数病理样品进行常规固定及石蜡包埋(FPE)，以进行组织学分析和后续建档贮藏。因此，因为这样的研究需要RNA的高度完整性，以便可以对基因表达进行准确测量，所以大多数活检组织样品不可用于基因表达的分析。目前，通过使用监测蛋白表达水平的免疫组织化学染色，仅可以定量监测这种固定和包埋样品中的基因表达水平。迄今为止，包括GST-π表达在内的定量基因表达研究一直局限于通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增来自新鲜或冷冻组织的RNA。医学专业人员使用冷冻组织相当不方便。当计划进行任何基于RNA的定量遗传标记测定时，首要关注的是活检组织的快速传递，以避免组织和后续mRNA降解。进行活组织检查的医学专业人员必须在一收到组织样品就马上将其送到准备好的设备上立即实施RNA提取方案。如果没有这样的设备可利用，则临床医师必须迅速地将样品冷冻，以防止mRNA降解。为了诊断设备在组织和RNA降解前实施有效的RNA提取方案，组织样品必须保持冷冻状态，直至其达到诊断设备，然而所述设备可能在很远的地方。在运输过程中用装有液氮和干冰的专用设备来保持冷冻组织的完整性造成花费巨大。常规活组织检查一般包括基质组织和瘤性组织的不均一混合物。与新鲜或冷冻组织不同，FPE活检组织样品容易地进行显微解剖并且分成基质组织和肿瘤组织，因此具有优于利用新鲜或冷冻组织的优点。然而，从固定组织、尤其是固石蜡包埋组织中分离RNA导致RNA高度降解，因而一般不适合进行基因表达研究。有许多技术用于从生物样品中纯化RNA，但没有一种技术可靠地从FPE样品中分离RNA。例如，Chomczynski(美国专利第5,346,994号)描述了一种基于使用苯酚和异硫氰酸胍的液相分离法从组织中纯化RNA的方法。将生物样品在苯酚和异硫氰酸胍水溶液中匀浆，然后将浆液与氯仿混合。离心后，浆液分成有机相、界面和水相。蛋白质汇集在有机相中，DNA汇集在界面中，而RNA汇集在水相中。RNA可以从水相中沉淀出来。遗憾的是，该方法不适合固定及石蜡包埋(FPE)组织样品。其它已知的用于分离RNA的技术通常或者使用胍盐，或者使用苯酚抽提，如在Sambrook，J.等，(1989)，第7.3-7.24页和在Ausubel，F.M.等，(1994)，第4.0.3-4.4.7页中描述的方法。同样，没有已知的方法提供从石蜡包埋组织样品中分离RNA获得可再现的定量结果。因此，特别需要用于从石蜡包埋组织样品中分离RNA的技术，以研究肿瘤组织中的基因表达，因为可以用某些受体或酶的表达水平来确定特殊治疗成功的可能性。需要一种从石蜡化组织中定量GST-πmRNA的方法，以对提出的基因毒性癌症疗法提供早期预测。结果，本领域共同的努力一直尚未成功地获得在固定和石蜡化本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种确定治疗患者肿瘤的基于铂的化疗方案的方法，所述方法包括：（ａ）获取肿瘤组织样品并固定所述样品，以获得固定肿瘤样品；（ｂ）从所述固定肿瘤样品中分离ｍＲＮＡ；（ｃ）采用在高严格条件下与ＧＳＴ－π基因的一个区段杂交的一 对寡核苷酸引物扩增所述ｍＲＮＡ，以获得扩增样品；（ｄ）测定所述扩增样品中的ＧＳＴ－πｍＲＮＡ量；（ｅ）将步骤（ｄ）的ＧＳＴ－πｍＲＮＡ量与内部对照基因的ｍＲＮＡ量进行比较；（ｆ）根据所述扩增样品中的ＧＳＴ－πｍＲＮＡ 量和ＧＳＴ－π基因表达的预定阈值水平，确定一个基于铂的化疗方案。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：KD达南伯格，
申请(专利权)人：应答遗传公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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