本发明专利技术属于生物工程技术领域，涉及一种新的可高产谷胱甘肽的酿酒酵母突变菌株，其分类命名为Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ５１８，以及该菌株所产的γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶基因与谷胱甘肽合成酶基因、利用该菌株制备谷胱甘肽的应用。本发明专利技术包含了ＮＴＧ连续诱导酿酒酵母出发菌株，经四次ＮＴＧ诱变处理后，得到突变株酿酒酵母Ｙ５１８。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ５１８菌株产生的γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶与谷胱甘肽合成酶发生了点突变，Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ５１８与原始菌株相比，有较强的耐酸性和ｐＨ耐受性，该突变株具有良好的稳定性，谷胱甘肽的产量显著提高。利用Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ５１８制备谷胱甘肽具有操作简单、稳定、重复性好，产量高等特点，实现了谷胱甘肽稳定、价廉，有利于规模化生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种酿酒酵母的突变菌抹 cewvh/ae Y518,该突变菌抹同时产，谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶，且两 种酶的基因均发生了点突变，本专利技术还涉及利用突变菌林Sacc/iarow少c^ twev^ae Y518 在发酵生产谷胱甘肽中的应用。
技术介绍
谷胱甘肽(GSH)是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成的生物活性 三肽化合物，是一种天然的抗氧化剂。GSH首先于1888年被分离得到，并且于1921 年被正式命名。GSH广泛存在于动物、植物和孩吏生物等生物体内。目前已经有许多文献 (Tateishi N.， 1974. J. B. 75: 93 103; Issels R., 1988. 5z'octem i^awwco/. 37: 881 888; Meister. A., 1983. j朋.仏v.历oc/ e附.52: 711 760.)报道了 GSH在动物细胞内的代谢和 生理功能，以及其高产方法。在实际生产应用上，谷胱甘舦已经成功应用用于肝脏保护 剂、毒素清除剂和眼药水生产中，它也将是功能性健康食品中的一个有前途的成分。自20世纪六十年代起，采用生物法进行GSH的合成就日益引起广泛的关注。生物 法合成GSH主要有两种途径酶转化法和发酵法。其中发酵法又以采用廉价的糖类为 原料，利用微生物体内物质的代谢途径来生产GSH的方法备受青睐。 一般情况下，微 生物细胞中GSH的含量不高(仅为干重的0.5% 1.0%),过高含量的GSH容易破坏 体内业已平衡的氧化还原环境(Penninckx. M. J. 2002. FEMS 7eflW及ewwc/z, 2: 295 305)。因此，发酵法生产GSH的关键问题在于如何提高细胞密度以及细胞内的GSH 含量，而胞内GSH含量的提高通常是由菌种选育来实现的，现有技术主要公开了两种 方法 一是采用常规诱变育种选育高产菌林(Ikeno Y.. 1977. JP52087296; Kono G.. 1977. JP52125687;詹谷宇等，1990.药学学报，25: 494 499.) ; 二是利用遗传工程技术构建 具有GSH合成酶活性的基因工程菌(ohtake Y.. 1988，^gn'c 5!W C/iem, 52: 2753 2762; Christine L. H.. 1989. EP300168;李华钟等.微生物学报，2001, 41(1): 16 24.)。通过现 有技术的育种方法已经获得了部分高产GSH的新突变林，而这些育种方法仍将成为菌 种选育的重要策略。由发酵法合成GSH的微生物中，利用酿酒酵母Sacc/wramyce;y cerev/Wae发酵生产GSH,具有工艺简单，环境友好等特点，是GSH生产菌种中的热点研究菌种。由于酿 酒酵母Sacc/wo/ y^ey cewv/w'ae产生的y-谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶是合 成GSH的关键协同酶，因此寻求高稳定性及高活性的？谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱 甘肽合成酶突变菌并研究酶系基因序列特征，在提高菌种的GSH产量上具有重要意义。 现有技术中的酿酒酵母Sacc/wrawyc^ cerevWae菌林普遍存在的问题是，其一 ，对 酸耐受性较差，又因在发酵生产过程中GSH产生造成发酵液体系pH值降低，使菌林生 长较差，生物量的积累量有限，从而使得微生物的发酵能力大大降低；其二，杂菌污染 是酵母质量不稳定的重要原因之一，表现为酵母细胞数少，出芽率低，使培养液的pH 妨碍了酵母生长。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是提供一抹高产谷胱甘肽酿酒酵母突变菌林，通过对酿 酒酵母&a^arawycw cewv/w'ae出发菌林的诸变及选育，可得到GSH发酵产量高，突 变后稳定性好，对发酵体系酸性耐受性强的新菌林，因此可通过该菌冲朱发酵，高产谷胱 甘肽。为解决上述技术问题，本专利技术通过下述技术方案实现一、本专利技术通过对出发菌林酿酒酵母Sacc/zaro/^c^ cwev/w'ae的诱变及选育，得到 一抹酿酒酵母突变菌抹，分类命名为Sacc/zflram;;c^ cewvWae Y518,其保藏登记号为 CCTCC NO: M 208137。(一) 菌林的来源及诱变方法、形态特征通过亚硝基胍(NTG)对出发酿酒酵母菌林Sflcc/iarawycescewv/s/ae (购自湖北安 琪酵母股份有限公司)进行诱变处理，通过反复四次的诱变、初筛和复筛操作，得到一 林高产GSH且传代稳定的突变林，将其命名为Sacc^wwyces ce"v^/。e Y518。酿酒酵母Sacc/jaramyc^y cwev加'fle Y518的形态特征为化能异养；嗜温；趋酸； 兼性厌氧。该突变菌林30'C培养3天，菌落乳白色，光滑，圆形，全缘，粘稠，2.4 3.7腿。细胞圆形，单个，(2-3.6) x (4-12)阿。无性繁殖方式为芽殖。(二) 本专利技术根据GeneBank中检索到的，谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成 酶基因序列设计引物，克隆到酿酒酵母5"acc/zaraw;;c^ cerev/^Vze Y518中的，谷氨酰半 胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因。本专利技术分离克隆到酿酒酵母Sacc/jaramyces cerew'w'ae Y518的y-谷氨酰半胱氨酸合成酶的编码基因，它具有SEQ ID NO: 1所示的核芬酸序列，该序列可用于构建y-谷氨 酰半胱氨酸合成酶的基因工程菌，也可用于相关底物的转化及该酶分子结构改造等研 究。通过PCR法分离克隆了这一Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因，DNA全序列分析结果 表明，此序列为一个2037 bp开放读码框，编码产生678个氨基酸，起始密码子为ATG， 终止密码子为TAA,其氨基酸序列示于SEQ ID NO: 2。本？谷氨酰半胱氨酸合成酶与 原始菌林和数据库公布的，谷氨酰半胱氨酸合成酶(SGDNo.YGL101C)相比基因序列 存在六个碱基的差异，其特征在于核苷酸序列即185A变为185T、 282C变为282T、 1125C变 为ms丁、 ，c变为,t、 n^g变为i722T、 ,A变为，G;其特征还在于所编码的氨基酸序列与数据库公布的氨基酸序列存在一个氨基酸的差异，即Glu 62变为Val 62。本专利技术分离克隆到酿酒酵母&cc/zaTOW^c^ cewvWae Y518的谷胱甘肽合成酶的编 码基因，它具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列，该序列可用于构建谷胱甘肽合成酶 的基因工程菌，也可用于相关底物的转化及该酶分子结构改造等研究。通过PCR法分 离克隆了谷胱甘肽合成酶的基因，DNA全序列分析结果表明，此序列为一个1476bp的 开放读码框，编码产生491个氨基酸，起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,其氨 基酸序列示于SEQ ID NO: 4。本谷胱甘肽合成酶与原始菌抹和数据库公布的？谷氨酖半 胱氨酸合成酶(SGDNo.YOL049W)相比，其特征在于核苷酸序列存在三个碱基的差异， 即135A变为135G、 I61C变为161T、 3G6A变为3G6C;其特征还在于所编码的氨基酸序列与 原始菌林存在一个本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株酿酒酵母突变菌株，其分类命名为Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｙ５１８，其保藏登记号为ＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０８１３７。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王立梅，梅艳珍，齐斌，郑丽雪，许华伟，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。