本发明专利技术公开了一种微生物发酵生产谷胱甘肽的方法，在发酵培养基中加入蛋白水解物、复合维生素Ｂ，并将无机硫源改为有机硫源而大幅提高谷胱甘肽产量的方法。本发明专利技术采用产朊假丝酵母为谷胱甘肽生产菌株，其在含有蛋白水解物、复合维生素和有机硫的发酵培养基中谷胱甘肽的产量可达７～１０ｇ／Ｌ，还原型大于９８％。本发明专利技术的优点是在其它培养条件相同的情况下谷胱甘肽产量大幅提高，生产成本大幅降低，将改变谷胱甘肽依赖进口的局面。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物，是生物 体内一种重要的生理活性物质，特别对维持生物体内氧化还原环境起到十分重要的作用。 谷胱甘肽是属于含有巯基的、小分子肽类物质，具有两种重要的抗氧化作用和整合解毒作 用。谷胱甘肽分子结构中半胱氨酸上的巯基为其活性基团(故谷胱甘肽常简写为G-SH)，易 与碘乙酸、芥子气(一种毒气)、铅、汞、砷等重金属盐络合，而具有了整合解毒作用。谷胱 甘肽(尤其是肝细胞内的谷胱甘肽)具有非常重要的生理作用就是整合解毒作用，能与某 些药物(如扑热息痛)、毒素(如自由基、重金属)等结合，参与生物转化作用，从而把机体 内有害的毒物转化为无害的物质，排泄出体外。它在临床医药、食品工业、运动营养上的应 用不断增加，需求量不断增加。在临床上谷胱甘肽用于治疗和预防肿瘤、肝炎及肝损伤、解 毒、辐射病及辐射防护、抗过敏、改善某些疾病的病程和症状、养颜美容护肤、增加视力及眼 科疾病和抗衰老等作用。在内分泌调节的治疗中效果明显，并具有改善性功能、消除疲劳及 抑制艾滋病病毒的作用。作为一抗氧化剂在现代食品加工业中广范使用，并能增强食品营 养价值，改善食品风味。谷胱甘肽的另一主要生理作用是作为体内一种重要的抗氧化剂，它能够清除掉人 体内的自由基，清洁和净化人体内环境污染，从而增进了人的身心健康。由于还原型谷胱甘 肽本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被如 自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。人体红细胞中谷胱甘 肽的含量很多，这对保护红细胞膜上蛋白质的巯基处于还原状态，防止溶血保护红细胞免 遭氧化性破坏具有重要意义，而且还可以保护血红蛋白不受过氧化氢氧化、自由基等氧化 从而使它持续正常在发挥运输氧的能力。红细胞中部分血红蛋白在过氧化氢等氧化剂的作 用下，其中二价铁氧化为三价铁，使血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而失去了带氧能力。 还原型谷胱甘肽既能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能够将 高铁血红蛋白还原为血红蛋白，提高体内血红蛋白的含量。另外，维生素C也是体内一种重要的抗氧化剂。由于维生素C能可逆地加氢或脱 氢，故维生素C在体内许多氧化还原反应中有重要作用。例如，许多酶的活性基团是巯基 (-SH)，维生素C能够维持-SH处于还原状态而保持酶的活性；维生素C可以使氧化型谷胱 甘肽转变为还原型谷胱甘肽(GSH)，使机体代谢产生的过氧化氢(H202)还原；维生素C还 可保护维生素A、E及某些B族维生素免受氧化。因此，运用谷胱甘肽时，与维生素C并用， 能够提高其功效。GSH对于放射线、放射性药物或由于抗肿瘤药物引起的白细胞减少等症状能起到 保护作用。GSH能与进入机体的有毒化合物、重金属离子或致癌物质等相结合，并促其排出 体外，起到中和解毒作用。SH还可保护细胞膜，使之免遭氧化性破坏，防止红细胞溶血及促进高铁血红蛋白的还原，对缺氧血症、恶心及肝脏疾病引起的不适具有缓解作用。最新研究 还表明，GSH能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏作用，还可防止皮肤老化及 色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化能力并使皮肤产生光泽，另外，GSH在治疗眼 角膜病及改善性功能方面也有很好作用。谷胱甘肽具有的广谱解毒作用，不仅可用于药物， 更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用，随 着肽类物质研究的不断深入，肽类物质具有的神奇功能不断发现，对人体的健康事业发挥 越来越大的作用.第一个谷胱甘肽制备专利发表在1938年，隋后各国科学家对它的生产开发进行 了大量研究。总的说来生产谷胱甘肽的方法有萃取法、化学合成法、酶转化法和微生物发酵 法。萃取法是从含GSH的动植物中提取。由于含量太低此方法没有实际应用价值。化学合 成法曾用于早期GSH生产，但工艺复杂，得到的产品为混旋体，分离困难，产品纯度不高。酶 转化法目前还处于实验室研究阶段。在目前的4种方法中微生物发酵法最具有潜力。微生物发酵法生产GSH在我国研究主要是从上世纪90年代开始的，取得了一些成 绩，但国内发酵水平一直停留在2 3g/L，如中国专利CN200710036925. 1公开的发酵法 合成谷胱甘肽的方法。虽然中国专利CN200810019761. 6 一种谷胱甘肽的发酵工艺，也公 开了利用经过基因工程改造甲醇利用型酵母生产谷胱甘肽的方法，谷胱甘肽产量可以达到 6. 6g/L，但与国际水平7 10g/L(日本协和发酵)还有较大的距离。
技术实现思路
本专利技术提供一种产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽GSH的方法，其在含有蛋白水解 物为10 20g/L的发酵培养基中，以产朊假丝酵母Candidautilis(Henneberg)Lodder & Kreger-van Rij作为菌种发酵65 75小时，即可得到还原型大于98%，产量为7 10g/ L的谷胱甘肽。并当发酵生长10 20小时后，滴加复合维生素B和含硫氨基酸，加入量分别为 0. 5 lg/L，及1 2g/L，至发酵终止前8小时停止滴加。本专利技术所述的发酵培养基的组成如下葡萄糖70g，酵母提取物20g，蛋白水解物 20g，磷酸二氢钾0. 5g，硫酸镁0. 5g，三氯化铁0. Olg，水1000ml, pH 6. 0 7. 0。 所述蛋白水解物包括但不限于植物水解蛋白、动物水解蛋白。所述的复合维生素B包含但不限于Bl、B2、B6、叶酸，其浓度为0.05-0. lg/ L。优选的复合维生素B由B1、B2、B6、叶酸组成，其比例为Bl B2 B6 叶酸= 2 0. 2 0. 1 1。所述的含硫氨基酸包括但不限于L-蛋氨酸、L-半胱氨酸，其浓度为0. 01-0. 02g/ L0发酵培养温度28 32°C，发酵罐中培养基的溶解氧不低于20%。决定发酵成败的因素有三菌种、培养基和培养条件，这三者相互依存。专利技术人在 对生产菌种进行选育和培养条件研究的同时，重点对培养基进行了研究，在发酵培养基中 加入蛋白水解物，并在发酵过程中滴加复合维生素B及含硫氨基酸。本专利技术采用药典推荐菌种产朊假丝酵母(Candida utilis (Henneberg) Lodder & Kreger-van Rij)作为发酵菌种。本专利技术使用斜面、种子、发酵培养基及培养方法如下斜面培养基12Brix 麦芽汁1000ml蛋白胨4g琼脂16 20gpH 自然种子培养基葡萄糖30g蛋白胨20g酵母浸提物20g水 1000ml pH 6. 5 7. 2发酵培养基葡萄糖70g酵母提取物20g蛋白水解物20g磷酸二氢钾0. 5g硫酸镁0. 5g三氯化铁0. Olg水 1000ml pH 6. 0 7. 0摇瓶种子培养斜面种子挖块接种于种子培养基中，28_32°C培养16_24小时，摇 床转速200-220rpm。菌浓度大于15% (3000rpm 10分钟)、PH约5. 5-6. 2，无杂菌污染。此 种子可接种于发酵摇瓶或接种于二级种子瓶或种子罐。摇瓶发酵培养500ml摇瓶内装发酵培养基60-70ml，接种量3-5% (V/V)，28-32°C 培养65-75小时，摇本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微生物发酵生产谷胱甘肽的方法，其特征在于：包含如下步骤 １）种子培养：将斜面生长的产朊假丝酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ（Ｈｅｎｎｅｂｅｒｇ）Ｌｏｄｄｅｒ＆Ｋｒｅｇｅｒ－ｖａｎ Ｒｉｊ接种于种子培养基中，２８－３２℃培养１６－２４小时，摇床转速２００－２２０ｒｐｍ，３０００ｒｐｍ １０分钟离心收集菌体，制备成菌浓度大于１５％（Ｖ／Ｖ），ＰＨ约５．５－６．２的菌液备用； ２）发酵培养：将步骤１）的菌液接种至含有蛋白水解物１０～２０ｇ／Ｌ的发酵培养基中，接种量３－５％（Ｖ／Ｖ），２８－３２℃培养６５－７５小时，在培养时间１０－２０小时时滴加复合维生素Ｂ，其最终加量０．５－１ｇ／Ｌ；滴加Ｌ－蛋氨酸或Ｌ－半胱氨酸，其最终加量１－２ｇ／Ｌ；终止发酵前８小时停止滴加；得到还原型大于９８％，产量为７～１０ｇ／Ｌ的谷胱甘肽。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：何璧梅，汤华钊，刘忠荣，肖友元，吴四灵，李玲，
申请(专利权)人：成都自豪药业有限公司，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]
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