一种提高产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法技术

一种提高产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法，涉及发酵法制备谷胱甘肽的方法。本发明专利技术采用产朊假丝酵母为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养或发酵罐培养，在发酵培养基中添加Ｌ－半胱氨酸，增加发酵液中Ｌ－半胱氨酸的供应，以提高产品谷胱甘肽的合成速度和产量。本发明专利技术的优点是在其它培养条件相同的情况下，在发酵液中添加Ｌ－半胱氨酸后可以将谷胱甘肽的产量和胞内含量提高将近一倍。这将大大有利于实现发酵法制备谷胱甘肽的产业化生产。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

，涉及发酵法制备谷胱甘肽的方法。
技术介绍
谷胱甘肽(GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽化合物。GSH在自然界中主要存在于酵母、动物肝脏、肌肉和血液中，一些植物如蔬菜、豆类、谷物、薯类和菇类也含有GSH。作为一种含巯基的多肽物质，GSH是一种重要的生化药物，科学家们一直在研究它在各种生物体内的生理作用，以及在人体各种组织细胞中的含量和各种疾病与组织损伤的关系。另外，GSH在生物化学等基础研究领域中也一直受到人们的广泛关注。谷胱甘肽作为一种重要的生理活性物质，人们对其在临床医学、食品添加剂和运动营养学上的兴趣将日益增长，且需求量不断增加。临床上在抗辐射、肿瘤、癌症、氧中毒、衰老和协调内分泌的治疗中效果明显且无副作用。此外，GSH还具有改善性功能和消除疲劳的作用，近年来还发现GSH具有抑制艾滋病病毒的功效。在食品加工领域，作为一种抗氧化剂，谷胱甘肽具有增强食品营养价值和强化食品风味等功能。在体育运动领域，GSH能够提高体内血红蛋白的含量，并保护红细胞免遭氧化性破坏。因此，无论是在运动性贫血机理的探讨，还是训练过度的预防、运动性疲劳机理的探讨，以及运动营养的补充方面GSH都倍受人们的关注。自1938年发表的GSH制备的最早专利以来，国内外学者围绕GSH的生产开展了大量的研究。概括来说，目前谷胱甘肽的生产方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、酶转化法和发酵法。萃取法主要是通过萃取和沉淀的方法从含有GSH的动植物组织中进行GSH的分离提取，由于原料不易获得且GSH的含量极低，因此该法的实际应用价值不大。化学合成法生产GSH，即将L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸缩合成GSH。该法较早用于GSH生产，但操作过程复杂、耗时且得到的GSH是左旋体和右旋体的混合物，分离十分困难，造成产品纯度不高，且生物效价很难保持一致。GSH的酶法合成是利用GSH合成酶系，在ATP的存在下将三种组成氨基酸催化形成GSH。该法首先需要获得GSH合成的相关酶系，其次需要加入价格昂贵的前体氨基酸和ATP，目前还处于实验室研究阶段。综合比较，发酵法生产GSH最具有竞争力，由于微生物容易培养，因此该法将具有极大的应用潜力。发酵法就是采用廉价的糖类原料，利用细菌或酵母体内物质的代谢途径来进行GSH生物合成的方法。一般情况下，微生物细胞中GSH的含量不高(＜1％)，过高含量的GSH容易破坏体内业已平衡的氧化还原环境。生物合成的GSH是胞内产物，实际生产过程中需要进行提取，较低的含量无疑会大大提高生产成本。因此，发酵法生产GSH的最关键问题在于提高微生物体内的GSH含量，通常是通过菌种选育来实现，采用常规诱变育种选育高产菌株或者利用遗传工程技术构建具有GSH合成活性的基因工程菌。此外，对发酵过程进行控制和优化也是提高GSH产量的有效办法。日本很早就开始对发酵法生产GSH进行研究，其中利用酵母发酵的方法已被日本成功地用于GSH的工业化生产。而在国内，自20世纪80年代末以来，中山大学和浙江大学等单位先后开展过这方面的研究，但结果都不很理想。自90年代中期开始，江南大学对GSH的生物合成进行了系统的研究，其中有关“发酵法生产谷胱甘肽”的研究，取得了可喜的成果。L-半胱氨酸(L-cysteine)是合成谷胱甘肽的前体氨基酸之一，在利用酵母发酵法合成谷胱甘肽过程中，胞内L-半胱氨酸的供应不足严重影响了谷胱甘肽的合成速度及产量。因此采用向发酵液中添加L-半胱氨酸以提高酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法将是可行的，但至今未见在利用产朊假丝酵母合成谷胱甘肽中添加L-半胱氨酸并明显提高谷胱甘肽产量的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术技术方案是采用在发酵液中添加L-半胱氨酸，添加时间为0-20小时，添加浓度为6-10mmol/L。(1)菌株产朊假丝酵母(Candida utilis)WSH 02-08，江南大学生物工程学院环境生物技术研究室保藏和提供。(2)培养基斜面培养基10％麦芽汁培养基；种子培养基(g/L)葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母膏10.0，pH6.0；发酵培养基(g/L)葡萄糖30.0，硫酸铵8.0，磷酸二氢钾3.0，硫酸镁0.25，pH5.5。(3)摇瓶培养斜面种子活化4小时后接入种子培养基，培养20小时后再按10％的接种量接入装有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中进行发酵培养，发酵时间24小时，发酵温度28-32℃，HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜，转速200r/min。在发酵液中添加L-半胱氨酸，添加时间为0-20小时，添加浓度为6-10mmol/L。(4)发酵罐培养斜面种子活化4小时后接入种子培养基，培养20小时后再按10％的接种量接入装有4L发酵培养基的全自动发酵罐KFT-7L(KoBio Techco.，Ltd，韩国)中，发酵时间24小时，发酵温度28-32℃，搅拌转速300r/min，通气量5.0L/min，pH5.5。在发酵液中添加L-半胱氨酸，添加时间为0-20小时，添加浓度为6-10mmol/L。最佳添加时间为16小时，最佳添加浓度为8mmol/L。(5)胞内谷胱甘肽的提取发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，在40％乙醇中30℃下处理2小时，离心取上清液作为样品进行谷胱甘肽测定。(6)细胞干重的测定一定量的发酵液离心后用蒸馏水洗涤3次，得到的新鲜细胞在60℃下烘48小时至恒重。(7)谷胱甘肽胞内含量的定义 (8)葡萄糖质量浓度的测定3，5-二硝基水杨酸法。(9)谷胱甘肽的测定采用DTNB-谷胱甘肽还原酶循环法。本专利的有益效果GSH是一种重要的药物，在临床上的用途极广。GSH的抗氧化性能又使得它作为食品添加剂在食品加工业中倍受青睐。本专利技术对于实现GSH的国产化，改变我国谷胱甘肽原料药依赖进口的局面，同时为GSH作为食品添加剂得到大规模应用奠定基础。无论从理论还是从实践的角度来看，实现发酵法生产GSH的产业化，不仅能填补我国在这一领域的空白，对我国医药工业、临床医学和食品工业均具有重大的社会效益和经济效益。通过摇瓶和发酵罐中的结果比较可以看出，添加L-半胱氨酸对产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的提高都是非常有效的。在其它培养条件相同的情况下，L-半胱氨酸的添加最高可以将谷胱甘肽产量和谷胱甘肽胞内含量提高一倍。具体实施例方式实施例1 按照说明书中所述发酵条件制备谷胱甘肽，摇瓶中不添加L-半胱氨酸的实验结果细胞干重9-10g/L；GSH产量180-200mg/L；GSH含量1.8-2.1％。产生最佳结果的发酵时间为24小时。实施例2按照说明书中所述发酵条件制备谷胱甘肽，摇瓶中添加L-半胱氨酸的实验结果添加时间0-20小时；添加浓度6-10mmol/L；细胞干重9-10g/L；GSH产量300-410mg/L；GSH含量2.0-4.2％。其中最佳添加时间为16小时；最佳添加浓度为8mmol/L。实施例3按照说明书中所述发酵条件制备谷胱甘肽，7L发酵罐中不添加L-半胱氨酸的实验结果细胞干重14-16g/L；GSH产量220-300mg/L；GSH含量2.0-2.2％。实施例4按照说明书中所述发酵条件制备谷胱甘肽，7L发酵罐中添加L-半胱氨酸的实验结果添加时间0-20小时；添加浓度6-10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵制备谷胱甘肽的方法，其特征是采用产朊假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）ＷＳＨ ０２－０８为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养或发酵罐培养，在发酵液中添加Ｌ－半胱氨酸，添加时间０－２０小时，添加浓度６－１０ｍｍｏｌ／Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈坚，李寅，卫功元，堵国成，伦世仪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]