本发明专利技术提供源自产朊假丝酵母的编码谷胱甘肽合成酶的基因，而且，通过在适宜条件下培养经过谷胱甘肽合成酶编码基因修饰的产朊假丝酵母并且将得到的培养物或者其级分或者经过热处理的培养物或其级分与食物或饮料的原料混合来加工食物或饮料，从而进行含有γ－谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸、或半胱氨酰甘氨酸的食物的生产。
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
专利
本专利技术涉及来自产朊假丝酵母的谷胱甘肽合成酶编码基因和借助于该基因而使胞内谷胱甘肽含量升高或降低的产朊假丝酵母，以及利用这样的产朊假丝酵母所得到的食品。由此产生的γ-谷氨酰半胱氨酸和半胱氨酸，或者谷胱甘肽和半胱氨酰甘氨酸可应用于食品生产。相关领域说明半胱氨酸用在增强食品的香味和口感等用途上。蛋白水解法、半合成法等等均是已知的生产半胱氨酸的方法，而目前大多应用蛋白水解法和半合成法。为了用半胱氨酸提高食品的香味和口感，需要富含半胱氨酸的天然食物原料。然而迄今为止，已知的这类天然食物原料很少。同时，有报道说，有一种富含半胱氨酸的食物原料是通过加热或酶处理含有γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母提取物(酵母浸膏)后获得的(WO00/30474)。半胱氨酰甘氨酸是半胱氨酸和甘氨酸通过肽键键合的二肽。有报道称，把半胱氨酰甘氨酸和糖一起加热可得到能增加肉香的物质。虽然已经知道用肽合成法生产半胱氨酰甘氨酸，但几乎没人知道它是由天然原料生产出来的。另一方面，有报道说通过热处理或酶处理含有谷胱甘肽的酵母提取物可得到富含半胱基氨基酸的食物原料(JP2001-321117A)。在酿酒酵母中，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶以半胱氨酸和谷氨酸为底物合成γ-谷氨酰半胱氨酸。进而，谷胱甘肽合成酶以γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸为底物合成出谷胱甘肽。富含γ-谷氨酰半胱氨酸的酵母在WO00/30474；Otake等人的Agri.Biol.Chem.，54(12)3145-3150(1999)；Chris等人的Molecular Biology of the Cell.，8，1699-1707(1997)；Inoue等人的Biochimica et Biophysica Acta，1395，315-320(1998)等中均有报道。然而所有这些相关研究的文献都用的是酿酒酵母，并无应用产朊假丝酵母的文献报道。产朊假丝酵母是工业生产中重要的微生物，用来生产包括谷胱甘肽、几种氨基酸和酶(Journal of Bacteriology，1995，vol.177，No.24，p7171-7177)在内的生物化学上重要的物质。与酿酒酵母相比，产朊假丝酵母的特点是它可利用磷酸戊糖循环产生吡啶碱，并表现较弱的代谢抑制(Biotechnology，3，30(1993))。而且，因为实验研究多用酿酒酵母，所以少有关于产朊假丝酵母的发现。在此情况下，没有产朊假丝酵母如何合成谷胱甘肽的报道，仅有报道称，一种特殊的有锌抗性的产朊假丝酵母株系，在比正常酵母培养温度低5℃或更多的情况下，可产生大量的谷胱甘肽(JP03-18872B)。这样，在产朊假丝酵母中编码谷胱甘肽合成酶的基因没有报道，也没有通过控制胞内谷胱甘肽含量来生产应用于工业方面的物质的已知方法。专利技术概述本专利技术的目的之一是提供来自产朊假丝酵母的编码谷胱甘肽合成酶的基因，以及谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸及其提取物的含量很高的产朊假丝酵母。本专利技术的另一目的是提供含有谷胱甘肽、γ-谷氨酰半胱氨酸、半胱氨酸或半胱氨基甘氨酸的食物以及生产这样食物的方法。已有报道显示对每单位糖源来说产朊假丝酵母的生长好过酿酒酵母(Biotechnology，卷3，30页(1983))。而且，由于在严格的有氧条件下并没有产生乙醇作为副产物(Kondo et al.(J.Bacteriology，Dec.，1995，pp.7171-7177))，因而在培养过程中不十分需要注意副产物乙醇的影响。因此，本专利技术人认为从产朊假丝酵母得到的酵母提取物有很高的γ-谷氨酰半胱氨酸含量，比起从酿酒酵母中得到的酵母提取物来更为便宜，因而有利于工业生产。基于以上的概念，本专利技术人刻苦研究以达到前述的目标。结果，基于来源于其他生物体的酶的同源性，他们成功地从产朊假丝酵母中克隆得到编码谷胱甘肽合成酶的基因和编码γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的基因。他们发现通过基因修饰过的产朊假丝酵母具有高含量的γ-谷氨酰半胱氨酸，因此本专利技术得以完成。本专利技术基本如下(1)编码定义为如下(A)或(B)的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有包括一个或几个氨基酸替代、缺失、插入或添加的SEQ IDNO2的氨基酸序列，并且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。(2)如(1)中所述的DNA，且其定义为如下(a)或(b)(a)含有SEQ ID NO1中从58到1485位核苷酸的核苷酸序列的DNA；(b)能与含有SEQ ID NO1中从58到1485位核苷酸的序列的DNA或者与由所述的核苷酸序列制得的探针在严苛的条件下相杂交的DNA，并且它们编码有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。(3)采用(1)或(2)中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少。(4)采用(1)或(2)中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性增加。(5)采用下述(c)或(d)中定义的DNA修饰过的产朊假丝酵母，它的谷胱甘肽合成酶活性为0.003μmol GSH/mg蛋白/小时或者更少(c)含有SEQ ID NO1中从58到981位核苷酸的核苷酸序列的DNA；(d)能与含有SEQ ID NO1中从58到981位核苷酸序列的DNA或者与由所述的核苷酸序列制得的探针在严苛的条件下相杂交的DNA。(6)如(3)到(5)中任一项所述的产朊假丝酵母，其中用SEQ IDNO3的DNA进一步修饰产朊假丝酵母以使其γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的活性提高。(7)食物或饮料，其含有可通过在适宜条件下培养权利要求3到6任一项中的产朊假丝酵母所得到的培养物，包含谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸的所述培养物的级分(fraction)，或者谷胱甘肽和/或γ-谷氨酰半胱氨酸中γ位谷氨酸经过热处理或酶处理而释放的所述培养物或级分。。(8)通过由在适宜条件下培养(3)到(6)任一项中的产朊假丝酵母得到的培养物生产的酵母提取物。(9)生产含有γ-谷氨酰半胱氨酸或半胱氨酸的食物的方法，该方法包括培养权利要求3到6任一项中的产朊假丝酵母，将得到的培养物或者其级分，或者经过热处理的培养物或其级分与食物或饮料的原料混合来加工食物或饮料。附图简述附图说明图1显示酿酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的替代盒(cassette for substituting)的构建图2显示酿酒酵母Nα4株系(strain)的构建图3显示产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因的表达载体的构建图4显示产朊假丝酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的表达载体的构建图5显示产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因中断盒(cassette fordisrupting)的构建(前半部分)图6显示产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因中断盒的构建(后半部分)专利技术详述此后，本专利技术将详细解释如下。<1>产朊假丝酵母谷胱甘肽合成酶基因本专利技术的DNA是编码定义为如下(A)或(B)的蛋白的DNA(A)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列SEQ ID NO2上替代、缺失、插入或添加一个或几个氨基酸得到的氨基酸序列，并且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。术语“谷胱甘肽合成酶活性”指的是催化由γ-谷氨酰本文档来自技高网...
【技术保护点】
编码定义为如下（Ａ）或（Ｂ）的蛋白的ＤＮＡ：（Ａ）具有ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸序列的蛋白；（Ｂ）具有包括一个或几个氨基酸替代、缺失、插入或添加的ＳＥＱＩＤＮＯ：２的氨基酸序列，并且具有谷胱甘肽合成酶活性的蛋白。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：西内博章，西村康史，
申请(专利权)人：味之素株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]
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