本发明专利技术是一种球状芽孢杆菌ＤＳ １１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ＤＳ １１）。该菌株为短杆状革兰氏阳性菌，菌株的生长温度范围为４－３５℃，最适生长温度为２８℃；生长ｐＨ范围为４－１１，最适生长ｐＨ为７；生长的ＮａＣｌ浓度为０．３％－１０％，最适ＮａＣｌ浓度为３％。可以耐受极性常数（Ｌｏｇ Ｐ）不大于２．０的有机溶剂。本发明专利技术还公开了一种利用上述球状芽孢杆菌产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法及按该方法得到的有机溶剂稳定性蛋白酶产品。该蛋白酶耐受有机溶剂的能力较强，可以用于有机相高效催化多肽的合成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种从中国黄海连云港海域的海水中分离得到球状芽孢杆菌DS11 (Sflc/〃w^;zaeWc^DS11);本专利技术还涉及该球状芽孢杆菌产有机溶剂 稳定性蛋白酶的方法与产品。
技术介绍
蛋白酶可以在水相催化肽键的水解，在有机相条件下催化肽键的合成， 是目前最广泛的酶制剂之一，广泛应用于多肽合成、蛋白质加工、食品、制 药、制革及洗涤剂等领域。蛋白酶在有机相催化肽合成时，要求蛋白酶耐受 有机溶剂。但是，有机溶剂对大多数酶类具有较强的毒害作用。通过酶的化 学修饰、包埋、固定、蛋白质工程和定向进化等手段可以提高酶对有机溶剂 的耐受性。但是这些方法成本高、操作复杂，如果酶在有机溶剂存在的情况 下具有高活性和稳定性，可以大大简化工序，降低成本。耐有机溶剂极端微生物是可以在较高浓度有机溶剂存在的环境中生长繁 殖的一类微生物。耐有机溶剂极端微生物往往产生有机溶剂稳定性酶类，如 脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶。因此筛选耐有机溶剂极端微生物成为获得有机溶 齐U禾急定性酶的主要手段。目前只发现尸化wdcw20"os aerag/"o^禾B Sacz'〃w sp. 可以产生耐有机溶剂蛋白酶。且并没有进行工业化生产，难以满足市场的需 要。国内关于耐有机溶剂微生物及有机溶剂酶稳定性类研究报道较少，目前 国内尚没有球状芽孢杆菌产有机溶剂稳定性蛋白酶的报道。筛选新型的有机 溶剂稳定性蛋白酶，对于丰富有机溶剂稳定性蛋白酶种类，满足工业化生产 需要和研究蛋白酶有机溶剂稳定性机制奠定基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种通过球状芽孢杆菌(&;"7/m ^/weWcus DSll) DS11来生产有机溶剂稳定性蛋白酶的 方法。本专利技术还公开了上述方法所产有机溶剂稳定性蛋白酶的性质。 本专利技术还公开了球状芽孢杆菌(Sac/〃ws ^/wen'cus DSll) DSll的分离培养方法。本专利技术中所涉及的生物材料球状芽孢杆菌DS11 (5ac/〃m ^/zaen'cus DSll)菌株是一种公开的菌株，已于2008年8月4日在Genebank公开，该 菌株的16SrDNA序列也己在Genebank公开，其长度为1467bp，登录号为 EU835735,网址为http:〃www.ncbi.nlm.nih.g;ov/entrez/viewer.fcg:i db=nuccore&id=194716764。该菌株为公知公用材料，在该专利申请日起二十年内，公众如果需要， 淮海工学院海洋学院实验室可对外提供。本专利技术是在上述公开的球状芽孢杆菌DSll (&c/〃us ^/wen'cw DS11)菌株的基础上研究其产机溶剂稳定性蛋白酶及产酶方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本专利技术是 一种球状芽孢杆菌DSll (Bflc/〃w ^/wen'cw DS11)，其特点是，它采用以下方法进行分离培养，将取自中国黄海连云港海域的海水水样1 ml添加到250 ml三角瓶装有50mL含10。/。苯的MLB液体培养基中，用橡胶塞塞住瓶口， 28°C， 160r/min培养4d后转接到新的MLB液体培养基中，如是3次；将所 得培养液稀释105倍后，吸取IO 涂布MLB培养基平板，在28t:培养箱 中培养2d，观察菌落形态，划线纯化至纯种后点种于SMA培养基平板，在 28 °C培养箱中培养2d，初步筛选出菌落直径与透明圈直径的比值大于5的 菌株，并将初筛菌株分别接种到产酶发酵培养基，28 °C， 180r/min培养48h 后，4 。C下8000 g离心10 min，测定上清液蛋白酶活性；分别取1 mL上清 液加入lmL苯，在30 。C， 180r/min振荡处理1 h后检测蛋白酶活力，苯处 理前后蛋白酶活性降低最小的菌株即为球状芽孢杆菌DS11 (&"7/m s/ Aaer/cMS DS11)。以下的专利技术人所做的关于菌株的鉴定。l.l形态特征革兰氏阳性、短杆状、大小为2.2-2.7iimx0.7-1.3pm、无荚膜、有芽孢。1.2在脱脂乳(SMA)固体培养基上的菌落特征直径2mm-4mm，白色、 湿润、边缘光滑、中间突起、易挑取，产生明显的透明圈。 1.3生理生化特征生理生化特征该菌过氧化氢酶、脲酶、MR试验均为阳性，氧化酶、 VP试验为阴性，不能产生吲哚，不产生H2S;可以水解凝胶、吐温_80、三 油酸甘油酯、酪蛋白，不能水解淀粉。菌株DS11可以利用葡萄糖、蔗糖、木 糖、甘露醇，不能利用麦芽糖、乳糖、棉籽糖、鼠李糖、丙二酸为碳源。通 过Bergey，s Manual of Systematic Bacteriology分析鉴定球状芽孢杆菌DS11。ac!7/w w/^er/cM DS11 )属于^^///w Sp.初步鉴定该菌为菌球状芽孢杆菌 (5ac/〃w s/ /z)。 1.4生长特征菌株的生长温度范围为4-36。C，最适生长温度为28。C (图l);生长pH 范围为4-11，最适生长pH为7 (图2);生长的NaCl浓度为0.3% - 10°/。， 最适NaCl浓度为3 % (图3)。可以耐受极性常数(Log P)低于等于2.0 的有机溶剂。表1菌株DS11的生理生化特征<table>table see original document page 7</column></row><table>"+"为阳性，"一"为阴性，1.4菌株DSll的分子生物学鉴定 16S rDNA PCR扩增和序列分析用Takara试剂盒提取DNA模板，并 于-40。C保存。正向引物P1: 5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引 物P2: 5'-CGGCTACCTTGTTACGAC-3'。反应体系50^1， Taq酶2U，反应条件为94。C预变性5min， 94。C变性30s， 54。C退火40s， 72。C延伸lmin， 35 个循环，72'C延伸7min。 PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生工生物工程 技术服务有限公司完成。扩增菌株GS230的16S rDNA，其长度为1467bp。 将该序列递交GenBank (登录号EU835735)并与GenBank数据库中的序列 进行同源性比较，发现菌株DSll与5acz7/w的16SrDNA自然类聚。选择与 其同源性高的菌株与DS11进行系统发育的构建，得出菌株DS11与S"a7/us ^/zfleho^(16SrDNA GenBank登录号AB116123)亲缘关系最近，进一步鉴 定该菌株为球状芽 包杆菌5a"'〃ws s/ /2fler/cws。关于本专利技术菌株产有机溶剂稳定性蛋白酶的方法。 1.1本专利技术中相关培养基脱脂乳(SMA)固体培养基(g/L):蛋白胨5.0，酵母粉3.0，脱脂奶 粉25.0，琼脂40，陈海水1000.0ml， pH7.0。MLB液体培养基(g/L):蛋白胨10.0，酵母粉5.0， NaCl 10.0， MgSO4'7H2O0.5， pH7.0。MLB固体培养基(平板)(g/L):蛋白胨10.0，酵母粉5.0， NaCllO.O， MgSO4'7H本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种球状芽孢杆菌ＤＳ１１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ＤＳ１１），其特征在于，它采用以下方法进行分离培养，将取自中国黄海连云港海域的海水水样１ｍｌ添加到２５０ｍｌ三角瓶装有５０ｍＬ含１０％苯的ＭＬＢ液体培养基中，用橡胶塞塞住 瓶口，２８℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养４ｄ后转接到新的ＭＬＢ液体培养基中，如是３次；将所得培养液稀释１０↑［５］倍后，吸取１０μｌ涂布ＭＬＢ培养基平板，在２８℃培养箱中培养２ｄ，观察菌落形态，划线纯化至纯种后点种于ＳＭＡ培养基平板，在２８℃培养箱中培养２ｄ，初步筛选出菌落直径与透明圈直径的比值大于５的菌株，并将初筛菌株分别接种到产酶发酵培养基，２８℃，１８０ｒ／ｍｉｎ培养４８ｈ后，４℃下８０００ｇ离心１０ｍｉｎ，测定上清液蛋白酶活性；分别取１ｍＬ上清液加入１ｍＬ苯，在３０℃，１８０ｒ／ｍｉｎ振荡处理１ｈ后检测蛋白酶活力，苯处理前后蛋白酶活性降低最小的菌株即为球状芽孢杆菌ＤＳ１１（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ ＤＳ１１）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕明生，房耀维，王淑军，刘姝，朱广超，
申请(专利权)人：淮海工学院，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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