一种微流控芯片及基于微流控芯片的细胞计数方法技术

本发明专利技术属于细胞计数与分类仪器，具体的说是一种微流控芯片及基于微流控芯片的细胞计数方法。本发明专利技术通过在微流控芯片设置并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。在细胞计数过程中，通过事先将微通道抽成负压状态，使细胞样品自动进入微通道。本发明专利技术具有制作简单，体积小、便于使用、样品消耗量少、计数方便且通量高等特点，可以很好的满足临床需求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞计数与分类仪器，具体的说是。
技术介绍
细胞计数在生物领域的科学研究和日常医学诊断过程中都具有重要意义。在癌症治疗药物的研发中，常需考察治癌药物对目标细胞的作用效果，需定量对细胞进行计数；医院内为对病人进行疾病的排查，需进行血常规的检查，所以需要对血液中各类细胞进行计数与分类；为考察癌症病人是否存在癌细胞扩散，也需对其血液内的癌细胞进行计数；有些感染了结核的病人并无症状显示，为了确诊其是否被感染，也需对其血液中结核杆菌的数目进行计数。细胞计数对于白血病患者显得尤为重要，为准确得知化疗过程中患者体内的造血骨细胞的数量以随时对治疗方案进行修正，医生需多次对患者血液中的细胞进行计数。据以上所述，细胞尤其是与疾病或癌症有关的细胞的计数显得异常重要，而发展出能量高、计数准确且易于操作的便携式细胞计数器显得尤为重要。目前已有一些细胞计数装置，比如流式细胞仪，通过细胞的荧光信号或非荧光的散射信号对细胞进行分选和计数，这种方法能量大，且能自动进行计数，但是仪器体积大，价格高，专业性强，所以它的通用性受到很大的限制。除了流式细胞仪，还有细胞计数板也可用作细胞计数，但是这种方法计数速度很慢，消耗人力资源大。因此，目前已有的这些细胞计数方法难以满足当下各领域特别是临床领域的需求。
技术实现思路
针对
技术介绍
的不足，本专利技术通过在微流控芯片设置并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。在细胞计数过程中，通过事先将微通道抽成负压状态，使细胞样品自动进入微通道。本专利技术具有制作简单，体积小、便于使用、样品消耗量少、计数方便且通量高等特点，可以很好的满足临床需求。本专利技术的目的是提供一种高通量的细胞计数与分类芯片，具有样品消耗量少、通量高且操作简易的特点。本专利技术的技术方案是:一种微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS与基片键合在一起，其特征在于:所述的PDMS上包含有并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。如上所述的微流控芯片，其特征在于:所述的微流控芯片经真空过程后将整个产品?封。如上所述的微流控芯片，其特征在于:所述的基片为玻璃基片。本专利技术还公开了一种基于微流控芯片的细胞计数方法，包括以下步骤: 步骤一、为目标细胞做荧光标记；步骤二、制作细胞样品； 步骤三、细胞进样； 步骤四、图片获取及细胞计数与分类； 其特征在于:所述步骤三细胞进样的过程为:将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成负压状态，因此细胞会自动进样至微通道中，大部分细胞会停留在微通道的微腔室中。如上所述的细胞计数方法，其特征在于:所述的制作细胞样品具体为:采用离心的方法去除上清液，再在离心管中加入磷酸缓冲液，充分吹打后离心，去除上清液，再加入少量磷酸缓冲液即可制得细胞样品 如上所述的细胞计数方法，其特征在于:所述的步骤一是通过连接有荧光染料的抗体与细胞表面抗原反应后，离心去除过量的抗体；此处针对不同细胞可以选择不同抗体，且样品细胞有多类时，可以同时选择几种带荧光标记的抗体。本专利技术的技术效果体现在:本专利技术的微流控芯片具有制作简单，体积小、便于使用等特点。本专利技术的方法用连接有荧光染料的抗体对目标细胞进行选择性标记，特异性强；细胞进样时，由于微通道已被抽成真空状态，因此进样口的细胞样品会自动进样；微通道中体积小，所样品消耗非常少；CCD拍照后可通过软件对目标细胞进行自动计数，计数效率高；通过不同荧光标记的抗体可以同时对细胞进行计数和分类。【附图说明】图1微流控芯片掩膜示意图，白色部分为透光区域，黑色部分为不透光区域； 图2 (A)为微流控芯片阳模加工匀胶前烘步骤示意图； 图2 (B)为微流控芯片阳模加工曝光步骤示意图； 图2 (C)为微流控芯片阳模加工后烘步骤示意图； 图2 (D)为微流控芯片阳模加工坚模步骤示意图； 图3为微流控芯片示意图； 图4 (A)所拍细胞明场图； 图4 (B)所拍细胞暗场图。【具体实施方式】名称解释:PDMS为聚二甲基硅氧烷的英文缩写 PGMEA为丙二醇甲醚醋酸酯的英文缩写 下面结合附图对本专利技术做进一步地详细说明。本专利技术所述的高通量细胞计数与分类方法，包括以下步骤: 第一步、为目标细胞做荧光标记。将一种或多种连接有荧光染料的抗体加至含有一种或多种目标细胞悬液的离心 管中，充分混合均匀，常温下孵育10分钟。第二步、采用离心的方法去除上清液，再在离心管中加入磷酸缓冲液，充分吹打后离心，去除上清液，再加入少量磷酸缓冲液即可制得细胞样品。本步骤中的离心方法为:离心时间5分钟，每分钟转速1000转，后续步骤中将离心时间和转速在离心步骤中用括号标注。第三步、将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，由于芯片的微通道已被抽成负压状态，因此细胞会自动进样至微通道中，大部分细胞会停留在微通道的微腔室中，即细胞完成进样。微流控芯片的PDM S具有透气性，如果将整个PDM S放在真空干燥器，抽成真空后，整个PDMS层一直处于负压状态。拿出该产品放置在一般的环境中，该产品还能保持5分钟至10分钟的负压，只要此时将细胞样品滴加至微流控芯片的入口，细胞便会自动进样至微通道中。第四步、进样后，将芯片静置约10分钟，即可在显微镜下用C⑶进行荧光照片的拍摄。目标细胞带有荧光，在荧光照片上体现为亮点，而非目标细胞不会呈现亮点；若同时存在多类目标细胞，则可通过选取不同滤片组对相应目标细胞进行荧光照片的采集。最后采用软件例如Image Pro Plus对目标细胞(即图片中的亮点)进行自动计数，然而根据成像区域的体积和成像区域内的目标细胞数目即可算出目标细胞的浓度。下面通过一个具体的实施方式对本专利技术做进一步的说明。实例1:检测人血中自免细胞的数目。人血中含有的白细胞内有部分是自免细胞，且人与人之间自免细胞所占白细胞比例有较大差异，对自免细胞数目的测定非常重要。自免细胞表面有CD4抗体，可用连接有荧光素的CD4抗体对其自免细胞进行特异性标记，然后根据荧光场下图片中的亮点个数对自免细胞进行计数。1.细胞样品制备 将取到的血液样本去除红细胞，用磷酸缓冲液缓冲液(pH 7.4)悬浮剩下的白细胞。取出200微升细胞液，离心(1000转每分钟，离心5分钟)，去除上清液；加入50微升磷酸缓冲液缓冲液，加入10微升标记物(荧光素连接的⑶4抗体),混匀,常温孵育15分钟后，离心(1200转每分钟，离心10分钟)，去除上清液；加入I毫升磷酸缓冲液缓冲液，轻轻混匀，离心(1200转每分钟，离心10分钟)，去除上清液；再加入200微升磷酸缓冲液缓冲液制得最后的细胞样品。2.微流控芯片及其制作工艺。本专利技术的微流控芯片包括PDMS和玻璃基片，PDMS与玻璃基片键合在一起，所述的PDMS上包含有并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔；在进样前将阵列式微通道抽成真空状态；进样时，滴加于进样口的细胞即可自动进入微通道中。为了便于微流控芯片的使用，在产品制作完成后，将其放置在真空干燥器中，抽成真空后，使整个PDM S层一直处于本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS与基片键合在一起，其特征在于：所述的PDMS上包含有并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。

【技术特征摘要】
1.一种微流控芯片，包括PDMS和基片，PDMS与基片键合在一起，其特征在于:所述的PDMS上包含有并行排列的阵列式微通道，每条微通道包含有进样口和出样口以及多个捕获细胞的微腔室；在进样孔口处打孔，出样口处不打孔。2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述的微流控芯片经真空过程后将整个产品密封。3.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于:所述的基片为玻璃基片。4.一种基于微流控芯片的细胞计数方法，包括以下步骤: 步骤一、为目标细胞做荧光标记； 步骤二、制作细胞样品； 步骤三、细胞进样； 步骤四、图片获取及细胞计数与分类； 其特征在于:所述步骤三细胞进样的过程为:将细胞样品滴加至微流控芯片的...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯晓均，
申请(专利权)人：武汉斯坦姆赛尔生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：