一种利用293细胞生产制备溶瘤病毒的方法技术

本发明专利技术公开了利用293贴壁细胞和293sus悬浮细胞生产制备溶瘤病毒的方法，该方法利用贴壁或者悬浮的293细胞制备溶瘤病毒，利用293贴壁细胞优化出病毒扩增产毒的最优条件，包括最优的病毒感染复数（MOI）、病毒稀释液、病毒扩增时血清浓度、病毒收获时间及病毒扩增温度等条件；进一步，通过优化293sus悬浮细胞制备溶瘤病毒的方法，包括优化病毒感染复数（MOI）、病毒收获时间等条件，单细胞产毒量达到E4次方。进一步在高细胞密度扩毒时，病毒产量能达到4E10pfu/mL。两种293细胞均能高效、稳定生产制备出高滴度的病毒，为后续病毒的规模化生产提供了技术支持。

A Method of Producing Oncolytic Virus from 293 Cells

【技术实现步骤摘要】
一种利用293细胞生产制备溶瘤病毒的方法
本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种利用293贴壁细胞和293sus悬浮细胞生产制备溶瘤VSV病毒的方法。
技术介绍
目前，被批准可用以疫苗制备及病毒生产基质的细胞主要包括Vero、293、BHK、CHO等；哺乳细胞的大规模培养方式主要有三种：贴壁培养，微载体培养，无血清悬浮培养，这三种方式均可用于293细胞的大规模培养。在之前的实验中我们使用Vero细胞进行VSV病毒的生产制备，病毒滴度在E9pfu/mL，为了获得更高的产毒量、降低生产成本，以使工艺更具经济性，更有行业竞争力及后续纯化工艺的进行，这里我们尝试使用贴壁培养的293细胞和悬浮培养的293sus细胞进行VSV病毒的生产，以期得到更加高效、稳定、方便简易的生产VSV病毒的方法。癌症和常规的癌症治疗剂目前在情绪/身体痛苦、失去生命和增加医疗保健成本方面带来了显著的社会经济负担。常规的疗法显示出一些有益的临床效果但是伴随着产生降低患者的生活质量的毒副作用。临床治疗中需要有更有效的且更低的毒副作用的癌症疗法。目前小分子药物、单克隆抗体等被开发应用于肿瘤的新型治疗，但治愈率不高，有待更多的研究。另外，仅用单一药物治疗可能会导致肿瘤细胞出现耐药性，因此急需开发有效的生物治疗方法。溶瘤病毒是一种通过遗传学改变而具有复制能力的病毒，经过高度稀释的减毒病毒能利用肿瘤(靶)细胞中抑癌基因的失活或缺陷，选择性地在靶细胞内复制，最终导致肿瘤细胞的溶解和死亡，而在正常细胞内它只是少量存在或不能增殖。利用这种病毒进行的肿瘤治疗称为溶瘤病毒治疗。溶瘤病毒不但自身在肿瘤细胞内复制，导致细胞溶解和死亡；而且通过死亡的细胞释放出病毒颗粒，产生一种级联效应，放大溶细胞效果，直至肿瘤细胞被清除。同时，肿瘤细胞的破裂会导致肿瘤抗原从肿瘤细胞中释放，从而诱导体内系统性的抗肿瘤免疫反应，这可能会增强病毒的溶细胞活性。溶瘤病毒进入肿瘤细胞后由于自我复制可陆续破坏宿主细胞，进而向周围扩散，进入其他肿瘤细胞。如此反复循环，可发挥有效的抗肿瘤效果。随着RNA病毒遗传技术的进展，水疱性口炎病毒属载体已被开发成为一种有效的治疗制剂。VSV（水疱性口炎病毒）载体是一种高效的溶瘤弹状病毒载体，具有非常广的溶瘤范围。根据资料报道，VSV载体几乎能够侵染溶解所有的肿瘤细胞，在体外实验中VSV载体的溶瘤率都在50%以上，在体内实验中VSV载体能够显著延长荷瘤动物模型的寿命。VSV载体也被开发成为一种有效的疫苗载体，VSV载体作为疫苗载体应用到获得性免疫缺陷综合症病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和乙肝病毒等疫苗的研制过程中。因此水疱性口炎病毒载体具有非常好的应用前景。VSV为弹状病毒科成员，是一种不分节段单股负链RNA病毒，病毒基因组长约11kb并且不会整合到宿主基因组内，主要以节肢动物为传播媒介，可感染大多数哺乳动物。在自然界中，VSV感染猪、牛和马，并在口和足附近导致水痘性疾病。尽管有报道表明VSV可感染人，但是VSV在人类中没有导致任何严重的症状。VSV编码5种蛋白，包括核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、表面糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)。由VSV基质蛋白(M)阻断宿主细胞蛋白合成会诱导细胞死亡。VSV病毒颗粒呈子弹状或圆柱状，长度约为直径的3倍（150-180nm×50-70nm），病毒粒子表面有囊膜，囊膜上均匀密布短的纤突，长约10nm。VSV病毒粒子分子量为265.6×103±13.3×103KD，其中蛋白占74%，类脂质占20%，糖类占3%，RNA占3%。综上所述，一种能够稳定、高效、简便、节约成本的VSV病毒的生产工艺，将会具有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术旨在基于现有技术中存在的问题，提供一种利用293细胞高效稳定制备溶瘤病毒的方法。本专利技术采用的技术方案为，一种制备溶瘤病毒的方法，将病毒起始接毒感染复数按MOI=0.01-0.1，用DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液稀释后感染293贴壁细胞2-3h；然后吸弃病毒液，更换成含体积百分比为3%的FBS的DMEM培养基作为病毒扩增液，培养24h后收获病毒液。进一步地，该方法包括以下具体步骤：S1、在培养板的N个孔中的N-1个孔中加入293细胞（ATCC）悬液，体积为2mL，使细胞量达到5×105个/孔，37℃，CO2体积百分比为5%培养24h；S2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数，其余孔的细胞分别按MOI=0.01将病毒用DMEM-0作为病毒稀释液稀释至1mL并吸弃掉培养基，将病毒液分别加入到孔中，在37℃，CO2体积百分比为5%条件下感染2h-3h，其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属，具备特异性杀伤肿瘤细胞特性，并且可以在293细胞中扩增和复制，具备反复侵染293细胞的能力；S3、吸弃病毒液，加入含体积百分比为3-6%FBS的DMEM完全培养基2mL作为病毒扩增液，在37℃、体积百分比为5%CO2的条件下培养24h，收集病毒液2500rpm离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用。进一步地，其中S2中，可直接将病毒按MOI=0.01-0.1稀释至含3%FBS的DMEM培养基中直接感染293贴壁细胞，在37℃、体积百分比5%CO2的条件下培养24h，收集病毒液2500rpm离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用。本专利技术采用的另一技术方案为，一种制备溶瘤病毒的方法，将病毒按MOI=0.01感染293sus悬浮细胞，在37℃、体积百分比5%CO2的条件下培养24h。进一步地，该方法包括以下具体步骤：S1、在125mL细胞摇瓶中，接入293sus悬浮细胞，37℃，体积百分比为5%CO2培养，每隔一天按1500rpm离心5min进行换液；S2、取200μL细胞悬液至1.5mL管中吹打成单后进行计数，待细胞密度达到E7/mL左右时，离心更换新鲜培养基，按MOI=0.01将病毒液加入细胞中，在37℃，体积百分比为5%CO2条件下感染24h，其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属，具备特异性杀伤肿瘤细胞特性，并且可以在293sus悬浮细胞中扩增和复制，具备反复侵染293sus悬浮细胞的能力；S3、收集病毒液3500rpm离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用。进一步地，所述病毒为重组溶瘤弹状病毒，选自水疱性口炎病毒。进一步地，所述病毒为重组溶瘤弹状病毒，选自水疱性口炎病毒印第安纳株。进一步地，所述病毒为重组溶瘤病毒，选自VSVMuddSummer亚型株。本专利技术的另一目的在于进一步地提供一种大规模制备溶瘤病毒的方法，该方法根据上述两种方法制备溶瘤病毒，其中，制备中所用的培养容器替换为适合贴壁细胞培养的反应器（293贴壁细胞）或替换为适合悬浮细胞培养的滚瓶；制备中所用的病毒稀释液的体积及病毒扩增液的体积以等比例扩大，为制备中体积的2.5-20倍。本专利技术的再一目的在于提供一种重组溶瘤弹状病毒，所述重组溶瘤弹状病毒根据上述方法得到，所述重组溶瘤弹状病毒包含改性基质蛋白(M)，所述改性基因蛋白（M）与减毒弹状病毒的M蛋白同样存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变，编码所述改性基质蛋白(M)的氨基酸序列与减毒弹状病毒的M蛋白（SEQI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产制备溶瘤病毒的方法，其方法包括：首先溶瘤病毒起始接毒量范围在MOI=0.01‑0.1，用DMEM‑0或opti‑MEM培养基作为病毒稀释液，稀释后在37℃感染293贴壁细胞2‑3h；然后吸弃病毒液，更换成含体积百分比为3‑10%FBS的DMEM完全培养基作为病毒扩增液，于37℃培养24h后收获病毒液，优选的将病毒按MOI=0.01‑0.1直接加入到含3%FBS的DMEM培养基中，然后加入到293生产细胞中，在37℃温度条件下感染24h后，收获培养上清液得到生产扩增后的病毒原液。

【技术特征摘要】
1.一种生产制备溶瘤病毒的方法，其方法包括：首先溶瘤病毒起始接毒量范围在MOI=0.01-0.1，用DMEM-0或opti-MEM培养基作为病毒稀释液，稀释后在37℃感染293贴壁细胞2-3h；然后吸弃病毒液，更换成含体积百分比为3-10%FBS的DMEM完全培养基作为病毒扩增液，于37℃培养24h后收获病毒液，优选的将病毒按MOI=0.01-0.1直接加入到含3%FBS的DMEM培养基中，然后加入到293生产细胞中，在37℃温度条件下感染24h后，收获培养上清液得到生产扩增后的病毒原液。2.根据权利要求1所述的一种制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：S1、在培养板的N个孔中的N-1个孔中加入293贴壁细胞（ATCC）悬液，体积为2mL，使细胞量达到5×105个/孔，37℃，体积百分比为5%CO2培养24h；S2、取其中一孔中的细胞消化后进行计数，其余孔的细胞分别按MOI=0.01-0.1将病毒用DMEM-0作为病毒稀释液稀释至1mL并吸弃掉培养基，将病毒液分别加入到孔中，在37℃，体积百分比为5%CO2条件下感染2h-3h，其中所述病毒为弹状病毒科水疱性口炎病毒属，具备特异性杀伤肿瘤细胞特性，并且可以在293细胞中扩增和复制，具备反复侵染293细胞的能力；S3、吸弃病毒液，加入含体积百分比为3-6%FBS的DMEM完全培养基2mL作为病毒扩增液，在37℃、体积百分比为5%CO2的条件下培养24h，收集病毒液2500rpm离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用；S4、进一步地，其中步骤S2中，可直接将病毒按MOI=0.01-0.1稀释至含3%FBS的DMEM培养基中直接感染293贴壁细胞，在37℃、体积百分比5%CO2的条件下培养24h，收集病毒液2500rpm离心15min，并使用0.22μm滤器进行过滤备用。3.一种制备溶瘤病毒的方法，其特征在于，优选的将病毒按MOI=0.01，感染293sus悬浮细胞（ATCC）；...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴飞，韦治明，秦晓峰，
申请(专利权)人：苏州奥特铭医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32