一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法技术

本发明专利技术公开了一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用悬浮BHK‑21细胞培养新城疫基因

A method of culturing Newcastle disease and avian influenza virus and preparing new bivalent vaccine

【技术实现步骤摘要】
一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法
本专利技术涉及一种兽用生物制品，具体说是一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法。
技术介绍
鸡是中国家禽养殖业的主要饲养对象，大规模和集约化养殖使鸡养殖业飞速发展，与此同时也给鸡病的控制带来了巨大的挑战。病毒性传染病对养殖业具有重大的危害性，而使用疫苗进行免疫接种则是控制这些疾病的最佳选择。目前使用SPF鸡胚扩增是禽用疫苗生产的主要方法，但该方法在疫病大规模暴发的情况下，很容易受到可靠的鸡胚来源、较长的培养周期、繁琐的操作步骤及易受污染等因素影响，人们很难在短时间内购置生产疫苗所需的数百万枚鸡蛋。基于此，世界卫生组织、美国政府等都鼓励发展细胞培养技术替代目前的鸡胚培养生产疫苗技术。当前世界各国都正在研究如何利用细胞培养来大规模生产禽病疫苗。随着细胞悬浮培养技术的普及，禽用疫苗在细胞上进行扩大培养已在国外推广应用。细胞悬浮培养制备疫苗工艺逐渐成为兽用生物制品行业发展趋势，目前国内有多个畜禽疫苗实现了细胞悬浮培养制备工艺。随着细胞悬浮培养技术的发展，悬浮细胞培养基成本随之降低，目前细胞悬浮培养可以克服传统鸭胚、鸡胚生产制备工艺的缺点，降低疫苗的批间差，提高疫苗品质；易实现规模化生产，可降低能耗、培养基、设备、人工等综合成本。
技术实现思路
本专利技术所要解决是鸡胚培养新城疫基因VII型病毒和H9N2亚型禽流感病毒的缺陷，是通过提供一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法来实现的。本专利技术的目的之一是提供一种利用悬浮BHK-21细胞培养新城疫基因VII型病毒的方法；本专利技术的目的之二是提供一种利用悬浮MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒的方法；本专利技术的目的之三是建立一种利用悬浮培养的新城疫基因VII型和H9N2亚型禽流感抗原制备新流二联疫苗的方法。为解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是：1.病毒：新城疫基因VII型病毒胚毒由实验保存，经12代BHK-21悬浮细胞适应性传代后保存于本实验室；H9N2亚型禽流感病毒胚毒由实验保存，经5代MDCK悬浮细胞适应性传代后保存于本实验室；2.细胞系：BHK-21悬浮细胞，MDCK悬浮细胞由本实验室传代保存；3.仪器设备：摇床、二氧化碳培养箱；4.细胞复苏扩繁：从工作库液氮中取出BHK-21、MDCK种细胞进行复苏，正常传代3-4代后扩繁准备接毒；5.新城疫基因VII型病毒接毒：将BHK-21细胞密度调整至2-4×106个/ml，接毒量为2％-1％，37℃二氧化碳培养箱培养72h，收获效价大于9的抗原；6.H9N2亚型禽流感病毒接毒：将MDCK细胞密度调整至5-6×106个/ml，接毒量为0.1％-0.01％，33℃二氧化碳培养箱培养48h，收获效价大于10的抗原；7.抗原灭活：新城疫基因VII型病毒抗原和H9N2亚型禽流感病毒抗原采用终浓度为0.1％甲醛进行灭活；8.油相佐剂：赛比克佐剂；9.水相配置：新城疫基因VII型病毒抗原和H9N2亚型禽流感病毒抗原灭活后离心，按1：2进行配比进行混合；10.配苗：油相与水相按7：3进行混合乳化。由于采用了上述技术方案，本专利技术具有以下有益效果：本专利技术可以克服传统鸭胚、鸡胚生产制备工艺的缺点，降低疫苗的批间差，提高疫苗品质；易实现规模化生产，可降低能耗、培养基、设备、人工等综合成本。附图说明图1为本专利技术中新城疫基因Ⅶ型病毒驯化数据。图2为本专利技术中H9N2亚型禽流感病毒驯化数据。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本专利技术方案，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。实施例一新城疫基因VII型病毒在BHK-21细胞上驯化实验。1.病毒：新城疫基因VII型病毒胚毒2.细胞系：BHK-21悬浮细胞3.仪器设备：摇床、二氧化碳培养箱4.细胞复苏扩繁：从工作库液氮中取出BHK-21种细胞进行复苏，正常传代3-4代后扩繁准备接毒。5.新城疫基因VII型病毒接毒：将BHK-21细胞密度调整至100万、200万、400万、600万四个梯度，接毒量为2％、1％、0.1％、0.01％四个梯度，培养温度为33℃和37℃两个环境，二氧化碳培养箱培养96h，按不同条件进行传代驯化，每代收获效价最高的病毒液作为种毒保存和继代种毒。6.经15代驯化传代观察，传代10代后新城疫基因VII型病毒效价基本稳定在10左右，我们确定F10-F12为生产用抗原的种毒批次，接毒量为2％-1％，培养温度为37℃，培养时间72h。7.每代最高抗原效价统计结果见图1实施例二H9N2亚型禽流感病毒在MDCK细胞上驯化实验。1.病毒：H9N2亚型禽流感病毒2.细胞系：MDCK悬浮细胞3.仪器设备：摇床、二氧化碳培养箱4.细胞复苏扩繁：从工作库液氮中取出MDCK种细胞进行复苏，正常传代3-4代后扩繁准备接毒。5.H9N2亚型禽流感病毒：将MDCK细胞密度调整至200万、400万、600万、800万四个梯度，接毒量为0.1％、0.01％、0.001％三个梯度，培养温度为33℃和37℃两个环境，二氧化碳培养箱培养72h，按不同条件进行传代驯化，每代收获效价最高的病毒液作为种毒保存和继代种毒。6.经10代驯化传代观察，传代3代后H9N2亚型禽流感病毒效价基本稳定在11左右，我们确定F3-F5为生产用抗原的种毒批次，培养温度为33度，培养时间为48h，病毒接毒量为0.1％-0.01％。7.每代最高抗原效价统计结果见图2实施例三新流二联疫苗制备1.试验目的：利用悬浮培养H9N2亚型禽流感病毒和新城疫基因VII型病毒抗原制备新流二联疫苗2.抗原灭活：H9N2亚型禽流感病毒和新城疫基因VII型病毒抗原信息见表1，灭活方式全部采用1‰甲醛，4℃灭活48小时。(20190527灭活，20190529制苗)。表1不同批次灭活抗原效价3.制苗方法：分装250ml疫苗瓶，疫苗批次编号为RD-017A1,RD-018A2,RD-019A3实施例四新流疫苗质量检验1.疫苗稳定性检验操作方法依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程进行。1)量取10毫升样品加入到15毫升离心管中，另取10毫升左右水，加入另一15毫升离心管中，用托盘天平配平(配平只增减水)。2)打开离心机电源，并将离心机设定3000转15分钟，后把两支离心管对称放入离心机中，开始离心。3)离心机停止后，取出装有样品的离心管观察，若水相析出小于0.5毫升为合格，大于0.5毫升为不合格。4)关闭离心机，将实验台，托盘天平，离心机清理干净，并做好仪器使用记录。2.测定油乳剂疫苗中甲醛残留量。操作方法依据现行《中国兽药典》二〇一五年版制定规程进行。1)空白对照品溶液的制备20％吐温-80乙醇溶液10ml，加水至刻度，摇匀，即得。2)标准对照品溶液的制备取已标定的甲醛溶液适量，配成每1ml含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0ml置50.0ml容量瓶中，加20％吐温-80乙醇溶液10ml，再加水至刻度，摇匀，即得。3)供试品溶液的制备用5ml刻度吸管量取样品5.0ml，置50m1容量瓶中，加20％吐温-80乙醇溶液10ml，再加水稀释至刻度，强烈震摇，静置至分层，下层液如果不澄清，注射器吸取下层液经0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用悬浮BHK‑21细胞培养新城疫基因

【技术特征摘要】
1.一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）利用悬浮BHK-21细胞培养新城疫基因型病毒，使其收获抗原效价大于9；（2）利用悬浮MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒，使其收获抗原效价大于10；（3）利用悬浮培养的新城疫基因型和H9N2亚型禽流感抗原制备新流二联疫苗。2.如权利要求1所述的一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法，其特征在于，利用悬浮BHK-21细胞培养新城疫基因型病毒时，培养细胞使用是悬浮BHK-21细胞，接毒细胞密度为2-4×106个/ml。3.如权利要求1所述的一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法，其特征在于，利用悬浮BHK-21细胞培养新城疫基因型病毒时，病毒为新城疫基因型病毒，接毒量为2%-1%。4.如权利要求1所述的一种培养新城疫、禽流感病毒并制备新流二联疫苗的方法，其特征在于，利用悬浮BHK-21细胞培养新城疫基因型病毒时，使用DrivingM®Tac-S101SBHK细胞无血清培养基，厂家上海倍谙基生物科技有限公司...

【专利技术属性】
技术研发人员：张恒，
申请(专利权)人：山东诸子生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37