一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法技术

本发明专利技术提供了一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，该方法可以大量降低生产成本，无需载体和血清，生产过程更为简便，无需细胞驯化或换液操作，且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高产品的产量及质量。一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：(1)种子细胞的培养及传代；(2)种子细胞的接毒；(3)病毒的收获和含量测定；其中，步骤(1)中，种子细胞为PK‑15B1，步骤(2)中，种毒为PRV ZJ011G，各步骤培养采用无血清细胞培养基CD PK15 259。

A method for producing porcine pseudorabies virus antigen by whole suspension cell culture

【技术实现步骤摘要】
一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法
本专利技术涉及一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，属于兽用生物制品领域。
技术介绍
猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)属于疱疹病毒科甲型疱疹病毒亚科成员，可引起新生仔猪中枢神经系统紊乱，生长猪呼吸道症状，并能导致妊娠母猪流产、死胎与弱仔。美国与部分欧洲国家已宣布消灭和根除该病。我国广泛使用该病基因缺失弱毒疫苗有效控制并逐步净化。但随着近年伪狂犬出现变异，毒力返强现象，传统毒株疫苗保护效果明显下降，因此市场急需变异毒株的伪狂犬疫苗。国内猪伪狂犬病毒的疫苗抗原生产主要采用转瓶培养方法，少数采用微载体悬浮培养方法。转瓶工艺生产半成品抗原效价为107.0～8.0TCID50/ml，转瓶工艺劳动强度大，生产一批需要100～200个大转瓶，需多人同时进行长时间的消化传代操作，增加污染风险；因培养基中含有一定浓度的血清，其制备的抗原中杂蛋白比较多，易造成免疫动物的应激反应；生产成本较高，人工、场地及原料费用大；对环境要求较高，需要较大的场地和符合GMP要求的高级别的净化厂房；不同生产批次及同一生产批次的转瓶之间生产的抗原效价存在较大差异，容易造成批内及批间的抗原质量差异，进而影响疫苗质量的稳定性。而微载体悬浮培养工艺，较转瓶工艺虽有提高，仍存在较大改进空间，另微载体昂贵，可重复利用次数较少，厂商建议重复利用2～3次，因此微载体成本占疫苗成本比例较高，此外，微载体扩大培养时的球转球工艺相对较难。另现有其它公司开发了伪狂犬全悬浮培养工艺(申请号CN201710318022.6；CN201710652407.6；CN2017100822116.8)，其使用ST或BHK21细胞，培养过程中需要对细胞进行驯化、添加血清或进行换液，培养获得的伪狂犬病毒最高滴度在108.5～8.9TCID50/ml，与其相比，本专利技术采用PK15细胞，培养过程细胞无需驯化、全程采用无血清细胞培养基，且无需换液，获得伪狂犬病毒滴度稳定在109.0TCID50/ml以上，具有明显优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有生产培养法的不足之处，提供了一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法。该方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％以上，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50％以上，无需载体和血清，生产过程更为简便，无需细胞驯化或换液操作，且该工艺占地小，可迅速进行规模化生产，对环境要求较低，自动化程度高，人工成本少，生产批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高产品的产量及质量。为了实现上述指标，本专利技术采取了如下技术方案：一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：(1)种子细胞的培养采用无血清细胞培养基CDPK15259，将种子细胞PK-15B1按照0.5～1×106个/ml的密度接入反应器，培养体积为反应器最终培养液体积的一半，并在37℃，80～120r/min转速的条件下培养；(2)种子细胞的接毒待种子细胞PK-15B1的细胞密度达到4～6×106个/ml时，将反应器最终培养液体积3％～5％的PRVZJ011G种毒液接入种子细胞中，所述PRVZJ011G种毒液病毒含量为106.5～7.0TCID50/ml，并在37℃，40～80r/min的条件下在反应器中维持1h后，加入无血清细胞培养基CDPK15259，达到反应器最终培养液体积，反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度50～100r/min；(3)病毒的收获和含量测定待细胞在反应器中培养了48后取样，进行细胞活力测定，如细胞活力下降至40～60％，将细胞培养液全部收获，否则，继续培养，并在24小时后再测定，将收获的抗原反复冻融3次后，再经过滤去除细胞碎片，作为猪伪狂犬病毒抗原半成品，进行病毒含量测定；所述无血清细胞培养基CDPK15259含有：DMEM/F1271.47％-93.75％(V/V)，硫酸葡聚糖0.1％～1.0％(m/V)，PluronicF681％-7％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.05％-0.15％(m/V)，软磷脂0.02％-0.08％(m/V)，草酰乙酸0.05％-0.2％(m/V)，柠檬酸0.03％-0.1％(m/V)，葡萄糖5％-20％(m/V)和双抗1％(V/V)。进一步的，无血清细胞培养基CDPK15259含有：DMEM/F1275％(V/V)，硫酸葡聚糖1.0％(m/V)，PluronicF685％(m/V)，氯化乙酰胆碱0.08％(m/V)，软磷脂0.05％(m/V)，草酰乙酸0.12％(m/V)，柠檬酸0.05％(m/V)，葡萄糖18％(m/V)和双抗1％(V/V)。进一步的，所述双抗为含10000IU/ml的青霉素和10mg/ml的链霉素溶液。进一步的，所述反应器可自动控制培养温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，容积为2L～3000L；培养温度为33～38℃、pH6.5～7.4、溶氧20％～80％、搅拌速度80～200r/min。进一步的，所述细胞活力测定采用美国Conterstar自动细胞计数仪结合台盼蓝染色法进行。微生物资源信息猪伪狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)ZJ011G株(保藏号为CGMCCNo.7957，由南京农业大学姜平教授提供)；PK-15B1株细胞(保藏号：CCTCCNo.C200936，由南京农业大学姜平教授提供)。本专利技术使用生物反应器全悬浮无血清培养生产PRV抗原，制备灭活疫苗，该专利技术方法可以大量降低生产成本，相比转瓶工艺单位抗原成本降低80％以上，较传统反应器培养工艺单位抗原成本降低50％以上，此专利技术无需载体，全程采用无血清细胞培养基，生产的疫苗安全性更高，同时制品的批间差异小，质量稳定易于控制，可明显提高制品的产量及质量，具体的：(1)本专利技术用生物反应器全悬浮培养工艺代替转瓶培养工艺生产猪伪狂犬病毒抗原，可解决生产效率低、产品质量不稳定、病毒效价低、成本高、成品苗不良反应强的问题，通过生产技术和工艺的改变，全面提高疫苗质量和产量，提升疫苗的安全性。(2)本专利技术应用生物反应器进行疫苗生产，较转瓶工艺自动化水平高，降低人工成本，生产工艺简单稳定，操作简便易扩大，较传统生物反应器工艺，无需使用微载体，避免使用胰酶进行细胞传代，从而避免胰酶对细胞的损伤，全程无血清培养且无需换液，操作简便，提高生产效率，PK15B1细胞对PRVZJ011G毒株敏感性高，提升了病毒抗原效价，进一步降低制苗成本。(3)本专利技术的产品病毒效价比传统转瓶细胞培养法提高10～30倍，病毒效价可以稳定在109.0TCID50/ml左右；抗原质量稳定，每罐收获的病毒抗原一致均一，易于规模化生产，且整个生产工艺过程带毒部分均完全在密闭的罐体和管道中进行，为封闭状态，不涉及传统转瓶生产工艺及传统反应器生产工艺所存在的其他生物安全和公共卫生问题。附图说明图1为仔猪攻毒后5日状态观察照片；其中，A为对照组，仔猪发热聚堆、厌食呕吐；B为实施例1疫苗组，仔猪体温正常、食欲正常；C为实施例4疫苗组，仔猪体温正常、食欲正常。具体实施方式以下结合说明书附图及具体实施例来对本专利技术作进一步的描述。实施例1——全悬浮细胞培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：(1)种子细胞的培养采用无血清细胞培养基CD PK15 259，将种子细胞PK‑15B1按照0.5～1×10

【技术特征摘要】
1.一种全悬浮细胞培养生产猪伪狂犬病毒抗原的方法，包括如下步骤：(1)种子细胞的培养采用无血清细胞培养基CDPK15259，将种子细胞PK-15B1按照0.5～1×106个/ml的密度接入反应器，培养体积为反应器最终培养液体积的一半，并在37℃，80～120r/min转速的条件下培养；(2)种子细胞的接毒待种子细胞PK-15B1的细胞密度达到4～6×106个/ml时，将反应器最终培养液体积3％～5％的PRVZJ011G种毒液接入种子细胞中，并在37℃，40～80r/min的条件下在反应器中维持1h后，加入无血清细胞培养基CDPK15259，达到反应器最终培养液体积，反应器控制条件为：pH7.0～7.4，DO20％～80％，搅拌速度50～100r/min；(3)病毒的收获和含量测定待细胞在反应器中培养了48后取样，进行细胞活力测定，如细胞活力下降至40～60％，将细胞培养液全部收获，否则，继续培养，并在24小时后再测定，将收获的抗原反复冻融3次后，再经过滤去除细胞碎片，作为猪伪狂犬病毒抗原半成品，进行病毒含量测定；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：董彦鹏，肖澄，钱建宁，罗顺，姜平，缪芬芳，张业忻，车巧林，王嘉琪，胡芳，沈燕，胡静雅，王彦奇，柴玮迹，耿晓眉，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，甘肃健顺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32