核碱基编辑器的AAV递送制造技术

本文提供了将“分裂的”Cas9蛋白或核碱基编辑器递送到细胞中的方法，例如经由重组腺相关病毒(rAAV)，以形成完整且功能性的Cas9蛋白或核碱基编辑器。将Cas9蛋白或核碱基编辑器分裂成两个部分，每个部分与内含肽系统的一个部分融合(例如，分别由dnaEn和dnaEc编码的内含肽‑N和内含肽‑C)。共表达后，经由内含肽介导的蛋白质剪接将Cas9蛋白或核碱基编辑器的两个部分连接在一起。还提供了用于递送分裂的Cas9蛋白或核碱基编辑器的重组AAV载体和颗粒，以及使用此类AAV载体和颗粒的方法。

AAV Delivery of Nucleic Base Editor

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核碱基编辑器的AAV递送相关申请根据35U.S.C.§119(e)，本申请要求2016年10月14日提交的美国临时申请U.S.S.N.62/408,575和2017年3月23日提交的美国临时申请U.S.S.N.62/475,780的优先权，其每一个通过引用并入本文。政府支持本专利技术是在国立卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的拨款号R35GM118062和R01EB022376下得到政府支持完成的。政府拥有本专利技术的某些权利。背景最近已经在包括基因疗法在内的广泛应用中探索了使用CRISPR/Cas9系统的精确基因组靶向技术。Cas9和基于Cas9的基因组编辑剂在基因疗法中的应用的主要限制是Cas9的大小(＞4kb)，阻碍其经由重组腺相关病毒(rAAV)的有效递送。专利技术概述本文描述了用于将Cas9蛋白或核碱基编辑器递送至细胞(例如经由重组腺相关病毒载体)的系统、组合物、试剂盒和方法。典型地，Cas9蛋白或核碱基编辑器“分裂”成N-末端部分和C-末端部分。Cas9蛋白或核碱基编辑器的N-末端部分或C-末端部分可以分别与内含肽系统的一个成员融合。当在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物，其包含：(i)第一核苷酸序列，其编码在C‑末端与内含肽‑N融合的Cas9蛋白的N‑末端部分；和(ii)第二核苷酸序列，其编码与所述Cas9蛋白的C‑末端部分的N‑末端融合的内含肽‑C，其中所述第一核苷酸序列或第二核苷酸序列与编码至少一个二分核定位信号的核苷酸序列可操作地连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.14 US 62/408,575;2017.03.23 US 62/475,7801.组合物，其包含：(i)第一核苷酸序列，其编码在C-末端与内含肽-N融合的Cas9蛋白的N-末端部分；和(ii)第二核苷酸序列，其编码与所述Cas9蛋白的C-末端部分的N-末端融合的内含肽-C，其中所述第一核苷酸序列或第二核苷酸序列与编码至少一个二分核定位信号的核苷酸序列可操作地连接。2.权利要求1的组合物，其中所述Cas9蛋白的N-末端部分包含对应于SEQIDNO:1的氨基酸1-573或1-637的SEQIDNO:1-275和394-397的任一个的部分。3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述Cas9蛋白的C-末端部分包含对应于SEQIDNO:1的氨基酸574-1368或638-1368的SEQIDNO:1-275和394-397的任一个的部分。4.权利要求1-3中任一项的组合物，其中所述内含肽-N包含如SEQIDNO:350-351和354-355的任一个中所示的氨基酸序列。5.权利要求1-4中任一项的组合物，其中所述内含肽-C包含如SEQIDNO:352-353和356-357的任一个中所示的氨基酸序列。6.权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列进一步包含与启动子可操作地连接的编码指导RNA(gRNA)的核苷酸。7.权利要求1-6中任一项的组合物，其中所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列进一步包含转录终止子。8.权利要求7的组合物，其中所述转录终止子是来自bGH基因、hGH基因或SV40基因的转录终止子。9.权利要求8的组合物，其中所述转录终止子是来自bGH基因的转录终止子。10.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述第一核苷酸序列或所述第二核苷酸序列进一步包含插入所述转录终止子的5′的土拨鼠肝炎转录后调控元件(WPRE)。11.权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述二分核定位信号包含选自下组的氨基酸序列：KRPAATKKAGQAKKKK(SEQIDNO:344)、KKTELQTTNAENKTKKL(SEQIDNO:345)、KRGINDRNFWRGENGRKTR(SEQIDNO:346)和RKSGKIAAIVVKRPRK(SEQIDNO:347)。12.权利要求11的组合物，其中所述二分核定位信号包含如SEQIDNO:344中所示的氨基酸序列。13.权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述Cas9蛋白是催化无活性的Cas9(dCas9)或Cas9切口酶(nCas9)，并且其中(i)的所述第一核苷酸序列进一步包含编码核碱基修饰酶的核苷酸序列，所述核碱基修饰酶与所述Cas9蛋白的N-末端部分的N-末端融合。14.权利要求1-12中任一项的组合物，其中所述Cas9蛋白是催化无活性的Cas9(dCas9)或Cas9切口酶(nCas9)，并且其中(ii)的所述第二核苷酸序列进一步包含编码核碱基修饰酶的核苷酸序列，所述核碱基修饰酶与所述Cas9蛋白的C-末端部分的C-末端融合。15.权利要求13或14的组合物，其中所述核碱基修饰酶是脱氨酶。16.权利要求15的组合物，其中所述脱氨酶是胞嘧啶脱氨酶。17.权利要求15的组合物，其中所述脱氨酶是腺苷脱氨酶。18.权利要求14-17中任一项的组合物，其中(ii)的所述第二核苷酸序列进一步包含在所述第二核苷酸序列的3′末端处的编码尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)的核苷酸序列。19.权利要求13-17中任一项的组合物，其中(i)的所述第一核苷酸序列进一步包含在所述第一核苷酸序列的5′末端处的编码尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)的核苷酸序列。20.权利要求18或19的组合物，其中所述UGI包含SEQIDNO:299-302的氨基酸序列。21.权利要求1-20中任一项的组合物，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列在不同的载体上。22.权利要求21的组合物，其中每个所述不同的载体是重组腺相关病毒(rAAV)的基因组。23.权利要求22的组合物，其中每个载体包装在rAAV颗粒中。24.组合物，其包含：(i)第一重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含编码在C-末端处与内含肽-N融合的Cas9蛋白的N-末端部分的第一核苷酸序列；和(ii)第二重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含编码与所述Cas9蛋白的C-末端部分的N-末端融合的内含肽-C的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列或第二核苷酸序列与编码至少一个二分核定位信号的核苷酸序列可操作地连接。25.细胞，其包含权利要求1-24中任一项的组合物。26.权利要求25的细胞，其中所述Cas9蛋白的N-末端部分和所述Cas9蛋白的C-末端部分接合在一起形成所述Cas9蛋白。27.权利要求25或26的细胞，其中所述细胞是原核细胞。28.权利要求27的细胞，其中所述细胞是细菌细胞。29.权利要求25或26的细胞，其中所述细胞是真核细胞。30.权利要求29的细胞，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：DR刘，JM莱维，WH叶，
申请(专利权)人：哈佛大学的校长及成员们，
类型：发明
国别省市：美国,US