耐碱的溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术属于溶藻弧菌噬菌体的研发技术领域，具体涉及耐碱的的溶藻弧菌噬菌体及其组合物和试剂盒。所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体VAP21（Vibrio alginolyticus phage VAP21），保藏编号为CCTCC NO:M 2018768。还公开了该溶藻弧菌噬菌体、或者溶藻弧菌噬菌体组合物、或含有溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在杀灭和/或预防弧菌属微生物中的应用。本发明专利技术具有宿主范围较广，低浓度下依然对宿主菌具有高毒性；而且在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可实现大规模工业生产。本发明专利技术能为噬菌体疗法的应用提供优良的菌株资源。

Alkali-resistant Vibrio alginolyticus phages and their compositions, kits and Applications

【技术实现步骤摘要】
耐碱的溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用
本专利技术属于溶藻弧菌噬菌体的研发
，具体涉及耐碱的的溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用。
技术介绍
溶藻弧菌是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌，无芽孢、荚膜，隶属于弧菌科、弧菌属，是一种常见的海洋致病菌，其数量居海水类弧菌之首。可对人引起伤口感染、食物中毒、中耳炎等疾病。同时，它也是鱼、虾、贝等海洋水养殖动物的一种条件致病菌，当环境恶化时机体免疫机能下降，溶藻弧菌病容易爆发。噬菌体是专门裂解细菌的一类病毒，主要化学成分由蛋白质和核酸组成，广泛存在于土壤、空气、水及生物体中，具有较强的专一性。由于其具备强大的杀菌能力，噬菌体可作为一种抗细菌感染制剂使用，自20世纪初以来一直受到国内外许多学者关注。关于溶藻弧菌噬菌体，付汉清等人(《微生物学通报》2018年6月25日期)分离得到一株溶藻弧菌噬菌体ФV170,该噬菌体ФV170可裂解15株溶藻弧菌中的7株,属于种内宽谱；最佳感染复数为0.01；一步生长曲线显示潜伏期为10min,裂解量为101.3；对65℃以上温度敏感。该噬菌体具有治疗海水养殖过程中溶藻弧菌病的潜力。专利技术专利CN103898015B公开了一种溶藻弧菌噬菌体及其在海参疾病预防中的应用，噬菌体对溶藻弧菌有抑制作用，在12h内无噬菌体抗性菌株产生。专利技术专利CN107904213A公开了一种溶藻弧菌噬菌体及包含该噬菌体的杀菌组合物，噬菌体可在短时间内快速抑制弧菌的生长，且抑制作用维持时间长。此外，该噬菌体的杀菌组合物安全、有效，且特异性强，生产成本低，在致病菌的控制过程中弥补了单一噬菌体疗法的不足。目前，关于溶藻弧菌噬菌体的研究主要集中在杀菌抑菌性方面，针对更多病原的溶藻弧菌噬菌体及其耐碱性的研究鲜见报道。综上，急需开发耐碱的的溶藻弧菌新型噬菌体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种耐碱的的溶藻弧菌噬菌体及其组合物、试剂盒和应用，具有耐碱的的特点。具体方案如下:一种耐碱的的溶藻弧菌噬菌体，所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)，保藏编号为CCTCCNO:M2018768。进一步的，所述溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)为烈性噬菌体，有一呈对称的头部和较长的尾部，头部为二十面体对称，长径L为60～70nm,横径W为60～70nm，L/W≈1；尾部包括可收缩的肌鞘和尾丝，肌鞘长度为30～40nm，宽5～10nm,尾丝具有2～3根；最适pH为pH7～pH11，4℃～65℃条件下具有耐性，MOI＝0.01条件下培养8～10h，其效价为2.5×1010pfu/mL。进一步的，所述溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。一种含有耐碱的的溶藻弧菌噬菌体的组合物，所述组合物含有所述溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)以及其它弧菌噬菌体中的至少一种。进一步的，所述组合物含有溶藻弧菌噬菌体VAP7(VibrioalginolyticusphageVAP7)，溶藻弧菌噬菌体VAP9(VibrioalginolyticusphageVAP9)和溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)中的两种或两种以上。进一步的，所述组合物包括溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)，还包括各噬菌体突变体中的一种或多种；所述突变体至少90％与对应的弧菌噬菌体的天然序列相同。一种耐碱的溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒。一种耐碱的溶藻弧菌噬菌体、或者溶藻弧菌噬菌体组合物、或含有溶藻弧菌噬菌体或溶藻弧菌噬菌体组合物的试剂或试剂盒在杀灭和/或预防弧菌属微生物中的应用：所述弧菌属微生物包括溶藻弧菌V.alginolyticus、鳗弧菌V.anguillarum、霍乱弧菌V.cholerae、非O1群霍乱弧菌non-O1V.cholerae、费氏弧菌V.fischeri、河流弧菌V.fluvialis、哈维氏弧菌V.harveyi、病海鱼弧菌V.ordalii、副溶血弧菌V.parahaemolyticus、杀鲑弧菌V.salmonicida、拟态弧菌V.mimicus、灿烂弧菌V.splendidus、金黄色弧菌V.azureus、产气弧菌V.gazogenes、创伤弧菌V.vulnificus、竹荚鱼弧菌V.trachuri、雀鲷弧菌V.damsela、漂浮弧菌V.natriegen、沙蚕弧菌V.nereis、鱼肠道弧菌V.ichthyoenteri、鲨鱼弧菌V.carchariae、坎氏弧菌V.campbellii以及杀对虾弧菌V.penaeicida中的一种或多种。本专利技术所述溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)在噬菌体效价、裂解溶藻弧菌的最佳感染复数(MOI)、pH稳定性、温度对噬菌体存活稳定性的影响等方面具有如下的生理特性和有益效果：(1)具有较高的效价(参见表1)，其中溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)感染溶藻弧菌的最佳MOI分别为1:100；并具有高度亲和性及裂解能力的烈性噬菌体，可迅速裂解溶藻弧菌(表2)；所述溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)在pH为7-11时生长活性所受影响小；对温度的热稳定性均相对较好；适宜4℃低温存放。(2)溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)无毒力基因或不良基因；供试噬菌体具有较宽的宿主范围，对180株溶藻弧菌的识别率达91.7％。(3)溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)对非致病性细菌的裂解：仅可识别10株副溶血性弧菌菌株中的3株、5株漂浮弧菌中的1株及3株金黄色弧菌中的1株。更进一步地、本专利技术所述溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)、或其组合物无法识别包括7株金黄色葡萄球菌、2株嗜水气单胞菌及6株大肠杆菌在内的非致病性细菌。(4)溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusVAP21)与非宿主性致病性细菌的互作，无法识别62株供试非宿主性致病性细菌中的任何一株。(5)溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)具有如下的优势：其为严格的烈性噬菌体且对宿主菌具有高毒性；具有较广的宿主范围；在非致病性细菌宿主上可较好增殖；可进行大规模发酵培养；其培养液可于室温下稳定存活，于4℃下可保存12个月。本专利技术未对供试噬菌体进行任何遗传修饰。因此，本专利技术的溶藻弧菌噬菌体VAP21(VibrioalginolyticusphageVAP21)能为开发噬菌体疗法提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。本专利技术中所述溶藻弧菌噬菌体的鸡尾酒组合可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种耐碱的的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体VAP21（

【技术特征摘要】
1.一种耐碱的的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述溶藻弧菌噬菌体为溶藻弧菌噬菌体VAP21（VibrioalginolyticusphageVAP21），保藏编号为CCTCCNO:M2018768。2.根据权利要求1所述裂耐碱的的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述溶藻弧菌噬菌体VAP21（VibrioalginolyticusphageVAP21）为烈性噬菌体，有一呈对称的头部和较长的尾部，头部为二十面体对称，长径L为60～70nm,横径W为60～70nm，L/W≈1；尾部包括可收缩的肌鞘和尾丝，肌鞘长度为30～40nm，宽5～10nm,尾丝具有2～3根；最适pH为pH7～pH11，4℃～65℃条件下具有耐性，MOI=0.01条件下培养8～10h，其效价为2.5×1010pfu/mL。3.根据权利要求1所述耐碱的的溶藻弧菌噬菌体，其特征在于，所述溶藻弧菌噬菌体VAP21（VibrioalginolyticusphageVAP21）具有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。4.一种含有权利要求1～3任一项所述耐碱的的溶藻弧菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有所述溶藻弧菌噬菌体VAP21（VibrioalginolyticusphageVAP21）以及其它弧菌噬菌体中的至少一种。5.一种含有权利要求4所述耐碱的的溶藻弧菌噬菌体的组合物，其特征在于，所述组合物含有溶藻弧菌噬菌体VAP21（VibrioalginolyticusphageVAP21），溶藻弧菌噬菌体VAP9（VibrioalginolyticusphageVAP9）保藏号为CCTCCNO:M2018766；和溶藻弧菌噬菌体VAP7（VibrioalginolyticusphageVAP7）保藏号为CCTCCNO:M2018767中...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔欢，陈海，徐旭凌，黄杰，费文斌，胡怿林，何四龙，丛郁，
申请(专利权)人：菲吉乐科南京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32