本发明专利技术公开了一种水貂伪狂犬灭活疫苗及其制备方法和用途。本发明专利技术的一种水貂伪狂犬灭活疫苗中含有的灭活后的保藏号为CGMCC No.12340的伪狂犬病毒株PRV‑DL14/08株，本发明专利技术还公开了所述水貂伪狂犬疫苗的制备方法。实验证明本发明专利技术制备的水貂伪狂犬灭活疫苗具有良好的安全性，免疫水貂后可并产生理想的免疫保护效果，因此可作为防控水貂等鼬科动物伪狂犬的候选疫苗株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种伪狂犬灭活疫苗及其制备方法和用途，特别涉及一种由伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株制备的用于水貂伪狂犬防控的灭活疫苗及制备方法，本专利技术属于生物
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的经济动物和家畜的一种急性传染病。其特征是发热、奇痒、内脏出血、脑脊髓炎等。猪的伪狂犬已有报道，近年来水貂临床病例也持续增加。该病早在1813年流行于美国的牛群中，1902年匈牙利学者奥叶兹基(Aujeszky)第一次较为详细的描述了该病，故命名为奥叶兹基病(又称Aujeszky氏病，Aujeszky’s disease,AD),1910年，Schmiedhofer通过过滤试验证实本病原为病毒且首先分离出病毒。刘永纯1984年报道了第一例猫感染伪狂犬以后，1956年周圣文又首次报道了哺乳仔猪感染伪狂犬的病例。伪狂犬在我国一直未得到彻底净化，而且在2011年以来，该病已经波及我国30多个省市和地区(包括香港和台湾地区)。目前，在我国的华北、东北地区以及河南、河北、山东、湖北、湖南、江西、江苏等地PR呈爆发流行。随着我国经济动物及毛皮动物养殖规模的逐年扩大，近年来水貂、狐、貉等毛皮动物通过食源的渠道感染伪狂犬病毒的情况也日益凸显，特别是PR造成的死亡率几乎高达100％，对养殖业危害巨大，因此，切实做好PR防控工作已迫在眉睫。疫苗是防控病毒性传染病的有效手段，因而研发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效疫苗具有重要意义。目前，我国的疫苗用毒株就有Bartha,Bartha-K61,Bucharest,BUK,HB-98,和SA215等，但我国近两年猪伪狂犬的爆发呈上升趋势，达到了前所未有的规模，且有的感病猪群曾接种过商品化疫苗。这表明我们所使用的疫苗株有的已经不能完全保护住伪狂犬野毒株的感染。而且目前还没有针对水貂的伪狂犬疫苗研制成功，鉴于此本专利技术开展了相关疫苗的研究工作。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种水貂伪狂犬灭活疫苗及其制备方法。使用该疫苗免疫水貂后可产生理想的保护效果，且具有良好的安全性。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：伪狂犬病毒株的分离与鉴定：2014年，病料采集自辽宁省某经济动物养殖场发病水貂脑、肝脏，病料经过研磨后，接种已长成单层的猪肾上皮细胞(PK15细胞)，对组织培养物用伪狂犬病毒(PRV)特异性引物进行PCR扩展鉴定gE和gD基因，扩增gE基因引物分别为gE-F和gE-R，扩增gD基因引物分别为gD-F和gD-R，如表1所示。并进行兔体致病性试验，证明分离的病毒为伪狂犬病毒株，命名为PRV-DL14/08，分类命名为伪狂犬病病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC No.12340；保藏时间：2016年05月31日；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。进一步的，本专利技术还提出了以上所述伪狂犬病毒株在制备防治伪狂犬疫苗中的用途。在本专利技术中，优选的，所述的伪狂犬病疫苗为水貂伪狂犬灭活疫苗。更进一步的，本专利技术还提出了一种水貂伪狂犬病灭活疫苗及其制备防治水貂伪狂犬病药物中的用途，所述疫苗中含有灭活后的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株。在本专利技术中，优选的，所述伪狂犬疫苗中含有的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株≥106TCID50/头份。再进一步的，本专利技术提出了一种制备以上所述的水貂伪狂犬灭活疫苗的方法，包括以下步骤：将所述的伪狂犬病毒PRV-DL14/08株增殖后进行病毒滴度测定，依所含免疫剂量，加入灭活剂及佐剂后制备而成，所述伪狂犬疫苗中含有的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株≥106TCID50/头份。在本专利技术中，优选的，所述的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株的增殖包括以下步骤：在已长成单层PK15细胞中，按体积百分比1％的比例接种伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株，置于37℃，5％CO2培养箱中，培养72h，反复冻融3次后收获，至-80℃保存，应不超过1年。在本专利技术中，优选的，所述的灭活剂为甲醛溶液，所述的佐剂为铝胶。在本专利技术中，优选的，所述的水貂伪狂犬灭活疫苗是通过以下步骤制备得到的：在已长成单层PK15细胞中，按体积百分比1％的比例接种伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株，置于37℃，5％CO2培养箱中，培养72h，反复冻融3次后收获病毒上清液，按2份体积的病毒上清液加5份体积的pH7.2-7.4 2％(w/w)氢氧化铝磷酸盐缓冲液的比例加入氢氧化铝磷酸盐缓冲液，然后用20％(w/w)氢氧化钠将pH值调至7.2-7.4，按总体积的0.15％加入甲醛溶液，振摇30分钟，然后放2-8℃灭活7日，期间每日上、下午各振摇1次，每次15-20分钟，加入25％(w/w)铝胶，每隔12小时震动30min，制备得到所述的水貂伪狂犬灭活疫苗。安全性和免疫原性实验结果表明，本专利技术制备得到的水貂伪狂犬毒灭活疫苗对水貂具有良好的安全性，免疫水貂后可产生理想的保护效果，可作为防控水貂伪狂犬的候选疫苗株。附图说明图1为PRV-DL14/08株gE和gD基因扩增结果图。其中，M为DL2000DNA Marker，1为gE基因片段扩增产物，2为gD基因片段扩增产物。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述专利技术，本专利技术的优点和特点交回随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或者替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1本专利技术PRV-DL14/08株的分离鉴定材料与方法1、病料和细胞病料采集自大连某经济动物养殖场发病死亡水貂脑、肝脏组织，PK15细胞有中国农科院特产研究所提供。2、病毒增殖发病死亡水貂及肝脏组织，用组织匀浆研磨后，用无血清DMEM培养液1:5稀释成悬液，加入青/链霉素至10000U/mL，反复冻融3次，经12000rmp离心15min取上清，接种已长成单层的PK细胞，于37℃，5％CO2，培养箱培养72小时，反复冻融3次，离心取上清，-80℃保存备用。3、分子生物学试剂DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；PCR扩增所用的EX Taq DNA聚合酶购自宝生物公司；胶回收试剂盒购自AXYGEN公司。4、引物设计利用Oligo 6.0软件设计合成扩增PRV中gE和gD基因的特异性引物，扩增gE引物分别为gE-F和gE-R，扩增gD基因引物分别为gD-F和gD-R，如表1所示：表15、gE和gD基因的PCR扩增程序：94℃预变性5min94℃变性30秒55℃退火30秒72℃延伸30秒循环过程30次72℃延伸10分钟PCR产物用AXYGEN胶回收试剂盒回收片段。6、连接与转化将胶回收的PCR产物于pMD18-T载体连接后，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，然后取出100μL菌液涂于含有氨苄青霉素(50μg/mL)的LB平板上，37℃培养18h。挑取白色单独菌落，接种于5mL含有氨苄青霉素(50μg/mL)的液体L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种伪狂犬病毒株，其特征在于，所述的伪狂犬病毒株命名为PRV‑DL14/08，其保藏号为CGMCC No.12340，保藏日期为2016年5月31日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
【技术特征摘要】
1.一种伪狂犬病毒株，其特征在于，所述的伪狂犬病毒株命名为PRV-DL14/08，其保藏号为CGMCC No.12340，保藏日期为2016年5月31日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。2.权利要求1所述的伪狂犬病毒株在制备防治伪狂犬疫苗中的用途。3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的伪狂犬疫苗为水貂伪狂犬灭活疫苗。4.一种水貂伪狂犬灭活疫苗，其特征在于，含有灭活后的权利要求1所述的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株。5.根据权利要求4所述的水貂伪狂犬灭活疫苗，其特征在于，所述伪狂犬灭活疫苗中含有的灭活后的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株≥106TCID50/头份。6.一种制备权利要求4或5所述的水貂伪狂犬灭活疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株增殖后进行病毒滴度测定，依所含免疫剂量，加入灭活剂及佐剂后制备而成，所述伪狂犬疫苗中含有伪狂犬病毒株PRV-DL14/08株≥106TCID50/头份。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的...
【专利技术属性】
技术研发人员：闫喜军，刘昊，李欣彤，胡博，鲁荣光，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。