【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于动物疫苗，具体涉及一种用大肠杆菌表达禽腺病毒蛋白并在体外组装形成病毒样颗粒的方法。
技术介绍
1、病毒样颗粒(vlp)被认为是安全、有效的病毒性疾病候选疫苗[1]。vlp是病毒大小的颗粒，具有棒状或二十面体的超分子结构[2]。它们由一个或多个重组表达的病毒结构蛋白组成，这些蛋白在不合并病毒基因组的情况下自发组装成颗粒。它们以有序和重复的方式展示抗原，从而诱导快速、强大的体液免疫反应以及有效的t细胞反应[3]。腺病毒作为在禽类当中传播的传染性疾病，对养禽业造成巨大的经济损失，因此急需开发出更安全有效的疫苗以预防腺病毒传播。有文献表明，腺病毒的penton base和fiber蛋白的重组杆状病毒在昆虫细胞当中表达可实现自组装形成vlp颗粒[4][5]。但是至今为止并没有在大肠杆菌中表达蛋白并在体外组装以形成vlp颗粒。
2、参考文献：
3、[1]jennings gary t,bachmann martin f,the coming of age of virus-likeparticle vaccines.[j].biol chem,2008,389:521-36.
4、[2]johnson j e,chiu w,structures of virus and virus-like particles.[j].curr opin struct biol,2000,10:229-35.
5、[3]grgacic elizabeth v l,anderson david a
6、[4]wang xinglong,tang qiuxia,qiu li et al.penton-dodecahedron of fowladenovirus serotype 4 as a vaccine candidate for the control of relateddiseases.[j].vaccine,2019,37:839-847.
7、[5]szolajska ewa,burmeister wim p,zochowska monika et al.thestructural basis for the integrity of adenovirus ad3 dodecahedron.[j].plosone,2012,7:e46075.
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种用大肠杆菌表达禽腺病毒蛋白并在体外组装形成病毒样颗粒的方法，本专利技术用大肠杆菌表达腺病毒的penton base和fiber蛋白，成功实现了用大肠杆菌表达系统表达的penton base和fiber蛋白在体外组装形成vlp颗粒。
2、本专利技术提供了一种体外组装形成病毒样颗粒的方法，包括以下步骤：(1)将来源于禽腺病毒的fiber蛋白的编码基因和penton base蛋白的编码基因分别插入到原核表达载体中，形成原核表达重组载体；
3、(2)将得到的两个所述原核表达重组载体分别转化到大肠杆菌表达菌株中，在iptg诱导下表达目标蛋白，收集菌体破碎上清液，得两种目标蛋白液；
4、(3)将所述两种目标蛋白液分别纯化后混合，透析后得病毒样颗粒。
5、优选的，步骤(1)所述禽腺病毒包括禽腺病毒8b血清型和禽腺病毒11血清型。
6、优选的，步骤(1)所述fiber蛋白和pentonbase蛋白来源于相同的禽腺病毒血清型。
7、优选的，将所述fiber蛋白的编码基因和penton base蛋白的编码基因分别插入原核表达载体前，还包括密码子优化，经优化后的fiber蛋白的编码基因的核苷酸序列如seqid no.1或seq id no.2所示，经优化后的penton base蛋白的编码基因的核苷酸序列如seqid no.3或seq id no.4所示。
8、优选的，步骤(1)所述原核表达载体包括pet-28a、pet-28b或pcold-i。
9、优选的，步骤(2)所述转化后，还包括将转化菌培养至od600值为0.6～0.8时，进行iptg的诱导表达。
10、优选的，步骤(3)所述纯化，包括采用亲和层析的方法，用ni-nta his band树脂装填柱子，最终用500mm咪唑洗脱目的蛋白。
11、优选的，步骤(3)所述两种目标蛋白的质量比为1:1。
12、优选的，步骤(3)所述透析包括在ph值为8.0的透析液中透析，所述透析的温度为4℃，时间为24h，每隔6h更换一次所述透析液；
13、所述透析液的组成包括0.15m nacl和20mm tris-hcl。
14、本专利技术还提供了利用上述体外组装形成病毒样颗粒的方法制备得到的病毒样颗粒。
15、有益效果：本专利技术提供了一种体外组装形成病毒样颗粒的方法，基于大肠杆菌表达的方式，大肠杆菌表达系统应用最广泛，有经济，快速，高产量的优势，本专利技术用大肠杆菌表达腺病毒8b血清型和11血清型的penton base和fiber蛋白，成功实现了用大肠杆菌表达系统表达的penton base和fiber蛋白在体外组装形成vlp颗粒。本专利技术首次用大肠杆菌表达系统表达禽腺病毒的fiber蛋白和penton base蛋白，并在体外实现自组装形成病毒样颗粒。
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1.一种体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)所述禽腺病毒包括禽腺病毒8b血清型和禽腺病毒11血清型。
3.根据权利要求1或2所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)所述fiber蛋白和penton base蛋白来源于相同的禽腺病毒血清型。
4.根据权利要求3所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，将所述fiber蛋白的编码基因和penton base蛋白的编码基因分别插入原核表达载体前，还包括密码子优化，经优化后的fiber蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，经优化后的penton base蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。
5.根据权利要求1或4所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)所述原核表达载体包括pET-28a、pET-28b或pCold-I。
6.根据权利要求1所述体外组装形成病毒样颗粒的
7.根据权利要求1所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)所述两种目标蛋白的质量比为1:1。
8.根据权利要求1所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，步骤(3)所述透析包括在pH值为8.0的透析液中透析，所述透析的温度为4℃，时间为24h，每隔6h更换一次所述透析液；
9.利用权利要求1～8任一项所述体外组装形成病毒样颗粒的方法制备得到的病毒样颗粒。
...【技术特征摘要】
1.一种体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)所述禽腺病毒包括禽腺病毒8b血清型和禽腺病毒11血清型。
3.根据权利要求1或2所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，步骤(1)所述fiber蛋白和penton base蛋白来源于相同的禽腺病毒血清型。
4.根据权利要求3所述体外组装形成病毒样颗粒的方法，其特征在于，将所述fiber蛋白的编码基因和penton base蛋白的编码基因分别插入原核表达载体前，还包括密码子优化，经优化后的fiber蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.1或seq id no.2所示，经优化后的penton base蛋白的编码基因的核苷酸序列如seq id no.3或seq id n...
【专利技术属性】
技术研发人员：高新乐，高玉龙，车巧林，承南，缪芬芳，周琳，张志华，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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