本发明专利技术公开了一种提升了安全性，表达密码子优化的Anti‑MART‑1 TCR基因的慢病毒载体制备及其应用。该载体的安全性通过将原慢病毒载体的WPRE元件替换成OPRE元件实现，该元件的序列如SEQ ID No.:1所示，并于载体多克隆位点处插入密码子优化的Anti‑MART‑1 TCR核苷酸序列，序列如SEQ ID No.:2所示。OPRE元件对慢病毒的转染效率和包装滴度与WPRE相比均无显著影响；密码子优化后的Anti‑MART‑1 TCR基因与野生型基因的同源性为79%，在T细胞基因修饰中能显著提升Anti‑MART‑1 TCR的表达水平；经过基因修饰表达Anti‑MART‑1 TCR的T细胞与黑色素瘤细胞株共培养后，其IFN‑γ的分泌水平也显著提高；该T细胞还能显著延长植入了黑色素瘤的荷瘤小鼠的生存时间，抑制黑色素瘤的增长。改造所得到的pRRLSIN.cPPT.MSCV‑CoAnti‑MART‑1/GFP.OPRE载体可用于细胞治疗中TCR‑T细胞的构建等用途。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种提升了安全性，表达密码子优化的Anti?MART?1 TCR基因的慢病毒载体制备及其应用。该载体的安全性通过将原慢病毒载体的WPRE元件替换成OPRE元件实现，该元件的序列如SEQ ID No.:1所示，并于载体多克隆位点处插入密码子优化的Anti?MART?1 TCR核苷酸序列，序列如SEQ ID No.:2所示。OPRE元件对慢病毒的转染效率和包装滴度与WPRE相比均无显著影响；密码子优化后的Anti?MART?1 TCR基因与野生型基因的同源性为79%，在T细胞基因修饰中能显著提升Anti?MART?1 TCR的表达水平；经过基因修饰表达Anti?MART?1 TCR的T细胞与黑色素瘤细胞株共培养后，其IFN?γ的分泌水平也显著提高；该T细胞还能显著延长植入了黑色素瘤的荷瘤小鼠的生存时间，抑制黑色素瘤的增长。改造所得到的pRRLSIN.cPPT.MSCV?CoAnti?MART?1/GFP.OPRE载体可用于细胞治疗中TCR?T细胞的构建等用途。【专利说明】一种提升安全性、用于表达密码子优化的Ant i-MART-1 TCR基 因的慢病毒载体的制备及其应用
本专利技术涉及基因治疗和细胞治疗领域，具体地涉及一种提升安全性，用于表达密 码子优化的Anti-MART-1 TCR基因的慢病毒载体及其应用。
技术介绍
黑色素瘤是是一种能产生黑色素的高度恶性肿瘤，多见于30岁以上成年人，常发 生于皮肤、粘膜和内脏器官。黑色素瘤在中国的发病率虽然低，但其恶性度高，转移发生早， 且预后多数较差，晚期可有淋巴道及血液转移，死亡率高，因此早诊断和早治疗非常重要。 对黑色素瘤的治疗，除传统的手术、放疗和化疗之外，细胞治疗也是一种重要手 段。目前，国内针对黑色素瘤的细胞治疗方法主要包括CTL(细胞毒性T淋巴细胞)和TIL(肿 瘤浸润淋巴细胞），但都存在一些问题:虽然CTL本身具有很好的靶向杀伤黑色素瘤的作用， 但其较难扩增的特性使其在黑色素瘤的治疗过程中很难发挥出色的效果;TIL是从黑色素 瘤组织中分离出的带有抗黑色素瘤活性的淋巴细胞，具有很好的杀伤黑色素瘤的活性以及 较好的扩增性，使其拥有较好的治疗效果;但TIL需要从病人经手术切除的黑色素瘤组织中 分离获取，而分离过程相对复杂，因此该方法的使用也受到了诸多限制。 2013年《Science》杂志评选出了十大科技突破，其中肿瘤的免疫治疗就是十大突 破之首，其包括的TCR-T技术将靶向肿瘤细胞表面表位的T细胞受体通过基因工程手段导入 到T细胞中，促使这些T细胞与肿瘤细胞结合并对其进行杀伤。Anti-MART-1 TCR是最早用于 抗黑色素瘤的TCR之一，其靶向黑色素瘤相关抗原MART-1:27-35表位氨基酸序列，且与黑色 素瘤细胞有很好的亲和力（Johnson,Heemskerk et al.2006)〇 将Anti-MART-1 TCR导入到T细胞中的基因工程手段以选用慢病毒居多。慢病毒可 以将外源DNA片段有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感 染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、免疫细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、 干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果。对于一些较难转导的细胞，如原 代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的DNA片段的转导效率， 能将目的DNA片段整合到宿主细胞基因组，可以方便快捷地实现目的DNA片段的长期、稳定 表达。 目前主流的慢病毒载体均为自身失活型（SIN，Self-InaCtivati〇n)慢病毒载体， 其包含的元件主要有5'和3'LTR(长末端重复序列）、RRE(Rev响应元件）、cPPT(多聚嘌呤通 道序列）、启动子、筛选标记、WPRE等。其中WPRE元件（Woodchuck hepatitis Posttranscriptional Regulatory Element)的全称为土拨鼠肝炎转录后调控元件，常见 于目前主流的慢病毒载体，可促进终止基因转录；同时可以促进转录物出核，还可以通过上 调初级转录物的多聚腺苷化，从而稳定胞内mRNA总量，最终提高转移基因的表达效率，具有 重要的作用。据专利技术人分析，WPRE基因序列当中存在一些潜在的启动子，可能会导致其下游 的X蛋白片段序列（部分)表达，导致某些潜在致癌可能性的基因表达，其结构如图1所示。 Patel等将荧光素酶报告基因融合到该X蛋白的表达框并转导细胞后，在细胞内检测到荧光 素酶的活性(Patel and 01sen2005)，这足以说明WPRE中所带的部分X蛋白序列会在细胞内 表达。而根据报道，X蛋白的表达并不会直接致癌，而是在特定的环境下(如在致癌基因表达 的情况下），以弱辅助因子的形式间接起到致癌的作用，其中C端截短的X蛋白（如WPRE中的X 蛋白片段）比全长的乂蛋白有更强的致癌能力（16^^(1；[1108,8；[116七6七31.1997)。在肝细 胞肝癌中，X蛋白的开放阅读框通常都会出现截短，而这些截短的X蛋白与全长的X蛋白相 比，有更强的提升细胞增殖能力的活性(Tu，Bonura et al. 2001)。ThemiS等报道，将含有截 短X蛋白的WPRE的慢病毒载体导入到胎鼠体内后诱导了肝细胞肝癌的产生(Themis, Mike, et al.2005)，人们对WPRE是否具备足够的安全性又有了更多的疑问。现有技术中，并未见针对WPRE进行改进提升慢病毒载体安全性的报道;另外，虽然 已经有将Anti-MART-1 TCR基因被导入到T细胞中并产生了抗黑色素瘤效果的报道，但这些 报道的效果远未达到最优，目前也未出现针对Anti-MART-1 TCR进行优化提升其效果的报 道。 参考文献 Johnson,L.Aet al.(2006).^Gene transfer of tumor-reactive TCR confers both high avidity and tumor reactivity to nonreactive peripheral blood mononuclear cells and tumor-infiltrating lymphocytes."The Journal of Immunology 177(9):6548-6559. Themis，Mike，et al?(2005)?"Oncogenesis following delivery of a nonprimate lentiviral gene therapy vector to fetal and neonatal mice. Molecular Therapy 12.4:763-771. Patel,M.and J.C.01sen(2005)//828.Optimizing the Woodchuck Hepatitis Virus Post-Transcriptional Regulatory Element(ffPRE)for Safety and Function in Lentiviral Vectors."Molecular Therapy 11:S3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种安全性提升的、抗黑色素瘤的慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体为将pRRLSIN.cPPT.MSCV/GFP.WPRE载体的WPRE元件被替换为更加安全的OPRE元件，并且插入了抗黑色素瘤表面抗原的TCR片段，命名为pRRLSIN.cPPT.MSCV‑CoAnti‑MART‑1.OPRE载体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨世成，毛侃琅，吕卫东，
申请(专利权)人：深圳精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。