基于IL-12稳定膜表达的肿瘤治疗剂及其制法和用途制造技术

本发明专利技术提供了基于IL-12稳定膜表达的肿瘤治疗剂及其制法和用途。具体地，本发明专利技术提供了一种IL-12/突变型CD62L融合蛋白。在本发明专利技术中，通过利用含IL-12/突变型CD62L融合基因的慢病毒修饰抗肿瘤T细胞。实验表明，本发明专利技术的融合蛋白可在T细胞的膜表面稳定表达,不依赖于抗肿瘤T细胞识别肿瘤时所伴随的野生型CD62L的切割。此外，膜表达本发明专利技术融合蛋白的T细胞一方面保持了高活力并有效地杀灭肿瘤细胞，另一方面具有显著降低的毒副作用和显著提高的安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药领域，具体地涉及一种基于IL-12稳定膜表达的高效低毒的肿瘤治疗剂及其制法和用途。
技术介绍
IL-12是一种非常重要的免疫刺激因子。IL-12是由共价键链接的异质性二聚体细胞因子，由p35和p40亚基组成，在体内由激活的免疫细胞分泌。IL-12是重要的细胞免疫调控因子，在抗感染免疫及恶性肿瘤的免疫中通过NK细胞以及CTL发挥作用。虽然IL-12具有显著的抑瘤效果，但是由于其系统性全身给药会引起全身性毒副反应，因而受到极大的限制。在本专利技术之前，IL-12的临床应用由于其所诱导的全身性毒副作用，以及早期临床试验通过全身系统性给药引起的两例患者的意外死亡，使其临床应用受到大大的限制。为了避免全身性给药的毒副作用从而实现临床应用的目的，临床科研工作者们通过肿瘤局部注射、瞬时表达及多点注射等途径应用于肿瘤的临床试验，但是由于IL-12的治疗效果同回输的IL-12的剂量直接相关，上述局部的临床方案并未有取得显著的抑瘤效果。为了解决这一问题，本专利技术人曾经试图通过基因修饰抗肿瘤T细胞持续分泌IL-12来实现抗肿瘤效果的最大化，但是由于未知的原因(一种可能的原因是IL-12的毒副作用)通过持续分泌IL-12方案基因修饰的T细胞在体外不能有效扩增，并引起大量的T细胞凋亡。综上所述，本领域尚缺乏高效且低毒副作用的基于IL-12的抗肿瘤药物。因此，本领域迫切需要开发高效且低毒副作用的肿瘤治疗药物。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供了一种高效且毒副作用低的肿瘤治疗药物及其制法和应用。在本专利技术的第一方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件：(i)任选的位于N端的信号肽和/或前导肽；(ii)第一蛋白元件；(iii)第二蛋白元件；以及(iv)任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的连接肽元件；其中，所述信号肽可操作地连于由(ii)、(iii)和(iv)所构成的融合元件；并且第一蛋白元件为IL-12蛋白元件；第二蛋白元件为突变型CD62L的蛋白元件，所述突变型CD62L的蛋白元件缺失了ADAM17的切割位点。在另一优选例中，所述的融合蛋白具有选自下组的结构：(1)式Ia所述结构：D-A-B(Ia)，或(2)式Ⅱa所述结构：D-A-C-B(Ⅱa)，其中，A为IL-12蛋白元件；B为突变型CD62L蛋白元件；C为任选的连接肽元件；D为任选的信号肽信号肽和/或前导肽序列；各“-”独立地表示连接上述元件的肽键或肽接头。在另一优选例中，所述的突变型CD62L的蛋白元件缺失了KLDKSFS序列中的部分序列或全部序列，从而导致无法被ADAM17切割。在另一优选例中，所述的“可操作地连于”指所述信号肽可引导所述融合元件的表达或跨膜转移(定位)。在另一优选例中，所述的连接肽元件包括序列如SEQIDNO.:7所示的连接肽。在另一优选例中，所述的IL-12蛋白来源于人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括野生型和突变型。在另一优选例中，所述的IL-12蛋白包括全长的、成熟形式的IL-12，或其活性片段。在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括IL-12蛋白的一个或两个亚基。在另一优选例中，所述的IL-12蛋白的亚基选自下组：P40和P35亚基。在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括连接在一起的IL-12蛋白P40和P35亚基。在另一优选例中，所述的P40和P35亚基为“头-头”、“头-尾”、“尾-尾”相连。在另一优选例中，所述的P40和P35亚基之间存在或不存在接头(linker)。较佳地，所述的接头为柔性的4-20个氨基酸的接头，更佳地，所述的接头为GGGGGGS(即G6S)(SEQIDNO.:8)。在另一优选例中，所述的IL12蛋白元件的序列如SEQIDNO.:4所示。在另一优选例中，所述的突变型CD62L蛋白元件中缺少了K283-S284切割位点。在另一优选例中，所述的突变型CD62L蛋白来源于人或非人哺乳动物。在另一优选例中，所述的突变型CD62L蛋白包括全长的、成熟形式的CD62L，或其活性片段。在另一优选例中，所述的突变型CD62L蛋白元件的序列如SEQIDNO.:6所示。在另一优选例中，所述的肽接头的长度为0-15个氨基酸，较佳地1-10个氨基酸。在另一优选例中，所述融合蛋白还包括信号肽元件D。在另一优选例中，所述的融合蛋白中，在单链IL-12(第一蛋白元件)和突变型CD62L(第二蛋白元件)之间设有连接肽，优选218肽段(SEQIDNO.:7)。在另一优选例中，所述的融合蛋白中，第一蛋白元件为单链IL-12，在所述单链IL-12中，在P40亚基及P35亚基设有连接肽G6S(SEQIDNO.:8)。在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.:2所示。在另一优选例中，所述融合蛋白具有以下多种特征：a)所述融合蛋白不能被ADAM17蛋白切割，从而不释放IL-12；b)所述融合蛋白包含IL-12的两条亚基,即P40和P35亚基,并由GGGGGGS(G6S)连接。在另一优选例中，所述的融合蛋白为单体、或二聚体。在本专利技术的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的多核苷酸的序列如SEQIDNO.:1所示。在本专利技术的第三方面，提供了一种载体，它含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的载体包括质粒、病毒载体。在另一优选例中，所述的病毒载体包括：慢病毒载体、腺病毒载体、黄热病毒载体。在另一优选例中，所述的载体包括表达载体。在本专利技术的第四方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它含有本专利技术第三方面所述的载体或基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括哺乳动物细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞包括免疫细胞，较佳地T细胞、在本专利技术的第五方面，提供了一种产生本专利技术第一方面所述的蛋白的方法，它包括步骤：(1)在适合表达的条件下，培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本专利技术第一方面所述的融合蛋白；和(2)任选地分离所述融合蛋白。在本专利技术的第六方面，提供了一种免疫细胞，所述的免疫细胞在膜表面上携带本专利技术第一方面所述的融合蛋白。在另一优选例中，所述的免疫细胞为至少103个(较佳地103-109个，更佳地较佳地104-108个)所述免疫细胞的细胞群。在另一优选例中，所述的免疫细胞或免疫细胞群中的全部或大多数(≥80％，较佳地≥90％)的细胞是活的。在另一优选例中，至少一部分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件：(i)任选的位于N端的信号肽和/或前导肽；(ii)第一蛋白元件；(iii)第二蛋白元件；以及(iv)任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的连接肽元件；其中，所述信号肽可操作地连于由(ii)、(iii)和(iv)所构成的融合元件；并且第一蛋白元件为IL‑12蛋白元件；第二蛋白元件为突变型CD62L的蛋白元件，所述突变型CD62L的蛋白元件缺失了ADAM17的切割位点。

【技术特征摘要】
1.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件：
(i)任选的位于N端的信号肽和/或前导肽；
(ii)第一蛋白元件；
(iii)第二蛋白元件；以及
(iv)任选的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之间的连接肽元件；
其中，所述信号肽可操作地连于由(ii)、(iii)和(iv)所构成的融合元件；
并且第一蛋白元件为IL-12蛋白元件；第二蛋白元件为突变型CD62L的蛋白元
件，所述突变型CD62L的蛋白元件缺失了ADAM17的切割位点。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有选自下
组的结构：
(1)式Ia所述结构：
D-A-B(Ia)，或
(2)式Ⅱa所述结构：
D-A-C-B(Ⅱa)，
其中，
A为IL-12蛋白元件；
B为突变型CD62L蛋白元件；
C为任选的连接肽元件；
D为任选的信号肽信号肽和/或前导肽序列；
各“-”独立地表示连接上述元件的肽键或肽接头。
3.一种分离的多核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨世成，吕卫东，
申请(专利权)人：深圳精准医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44