本发明专利技术涉及一种携带GFP的鸭MSTN基因高效过表达逆转录病毒载体。根据GFP基因序列，设计在起始密码子前含有Gly4Ser3连接肽linker序列的上游引物及有终止密码子的下游引物，扩增GFP片段，插入穿梭载体中得到重组穿梭载体pSlax‑13‑GFP。根据鸭MSTN基因mRNA序列，设计在起始密码子前含有Kozak序列的上游引物及去除了终止密码子的下游引物，扩增MSTN片段，插入重组穿梭载体得到重组穿梭载体pSlax‑13‑MSTN‑GFP，再将MSTN‑GFP片段插入逆转录病毒载体中得到携带GFP报告基因的鸭MSTN基因高效过表达逆转录病毒载体RCASBP.B‑MSTN‑GFP。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家禽基因工程
，具体涉及一种携带GFP的鸭MSTN基因高效过表达逆转录病毒载体，为在鸭胚细胞及组织中全面研究MSTN基因在鸭肌肉发育、生长等方面的功能奠定基础。
技术介绍
肌肉是动物胴体最重要的组成部分，肌肉的产量是肉用畜禽重要的经济性状，也是畜牧生产中最重要的生产方向。肌肉的发生是一个复杂的生理过程，肌细胞的分化、生长和发育受到一系列正向和负向调控因子双向调节控制，其中肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)是肌肉生长发育的负向调控因子，主要抑制骨骼肌的生长发育。在哺乳动物中，MSTN基因C端活性区缺失的突变型小鼠比野生型小鼠重30％左右，肌肉量是野生型的2-3倍；MSTN超表达的小鼠出现肌肉量减少，肌纤维大小、心肌量降低以及脂肪量增加等现象；慢病毒介导MSTN-shRNA转染的羊卵母细胞发育到桑葚期，部分胚胎能检测到GFP的表达，为MSTN在动物遗传育种上的应用提供了参考。在禽类中MSTN基因的RNAi实验表明，MSTN可以抑制鸡肌源性卫星细胞的激活、增生和分化，MSTN缺乏的鸡胚成肌细胞会出现分化延迟、形态改变的现象；在鸭中，MSTN-shRNA能促进鸭成肌细胞的增殖，影响生肌调节因子MyoD1、Myf5等的表达。基因功能的研究是通过改变靶基因的表达(一个是增强表达，另一个是减弱或者彻底终止其表达)，然后观察其对其他基因及个体表型的影响。目前关于MSTN基因功能的研究主要集中在利用RNAi技术抑制该基因表达方面，没有增强基因表达的研究报道。一个完整的基因功能验证实验设计，应该“患得患失”，减弱和增强两方面都要进行。而目的基因能否有效导入动物细胞或体内，并在其中高效表达同时保证细胞或机体的有效存活是基因功能研究的关键。在哺乳动物中，将外源基因导入真核细胞或体内的方法大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径，在禽类中比较常用的是电穿孔法和逆转录病毒介导法。利用电穿孔技术可实现靶基因在胚胎特定时间的特定区域迅速表达的目的，但不能持续表达；逆转录病毒介导法可使外源基因高效导入胚胎并得到长期稳定的表达。逆转录病毒属于一类含有逆转录酶的RNA病毒，逆转录病毒经寄主细胞表面的受体蛋白识别后进入细胞，然后在自身基因组编码的逆转录酶的作用下，以基因组RNA为模板反转录出双链DNA原病毒，双链DNA能随机整合到寄主细胞的染色体上，随着寄主细胞的复制而复制。目前在禽类中应用的逆转录病毒载体主要来源于禽类白血病病毒、莫洛尼小鼠白血病病毒以及慢病毒等。以禽肉瘤白血病病毒为骨架的逆转录病毒RCASBP(Replication-CompetentAviansarcoma-leukosisvirus，withaSpliceacceptor，BryanRSVPol)是一种具有自我复制能力的病毒，既能水平感染相邻细胞，也能垂直感染后代细胞，近年来得到了广泛的关注，已经在禽类鸡胚相关基因功能的研究中得到应用，利用这种逆转录病毒可实现靶基因在胚胎组织长期稳定的高效表达。RCASBP病毒有A-E不同的亚型，其中B亚型在实验操作中应用效果较好。因此，利用RCASBP.B构建一种携带GFP报告基因的鸭MSTN基因高效过表达逆转录病毒载体，实现MSTN基因在鸭胚细胞及组织中的过表达，是MSTN基因研究较集中的RNAi实验的重要补充，为全面研究MSTN基因在鸭肌肉发育、生长等方面的功能奠定基础。逆转录病毒载体RCASBP.B只有一个ClaⅠ限制性酶切位点可用于外源基因的插入，且该载体不含有荧光素酶(Luciferase)、绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)等报告基因，不利于后期简便、快速的检测利用。因此，需借助其他中间载体构建同时含有报告基因和目的基因的载体。穿梭载体pSlax-13含有HindⅢ、PstⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ等多个限制性酶切位点(用于目的基因与报告基因及其它元件的连接)及两个ClaⅠ限制性酶切位点(用于将目的基因与报告基因及其它元件的整体外源片段插入逆转录病毒载体RCASBP.B)。在前期的研究中，曾构建过携带GFP报告基因的鸡SMARCE1(SWI/SNF-relatedmatrix-associatedactin-dependentregulatorofchromatinsubfamilyEmember1)基因重组逆转录病毒载体RCASBP.B-GFP-SMARCE1(GFP报告基因直接插入在目的基因SMARCE1上游)，同时构建了不含GFP报告基因的鸡SMARCE1基因重组逆转录病毒载体RCASBP.B-SMARCE1，结果显示这两个重组载体均能实现SMARCE1基因的表达，但RCASBP.B-GFP-SMARCE1载体的效率显著低于RCASBP.B-SMARCE1载体(P＜0.05)，即携带GFP报告基因的重组载体不能实现目的基因的高效过表达，不易用于下一步目的基因的功能研究。为有效利用逆转录病毒载体RCASBP.B，使其携带GFP报告基因的同时能高效过表达目的基因，本专利技术将GFP报告基因与目的基因的连接顺序进行改变并引入其它相关元件，提供一种携带GFP的鸭MSTN基因高效过表达逆转录病毒载体及其构建方法。本专利技术将目的基因MSTN插入在GFP报告基因上游，并在目的基因起始密码子ATG上游引入可提高转录和翻译效率的Kozak序列，同时去掉目的基因的终止密码子TGA，在目的基因与GFP报告基因之间引入一段柔性片段linker序列形成(Gly4Ser)3连接肽，这段连接肽柔性较好，既可以将两个蛋白分开，又不会影响两个蛋白的构象结构和功能发挥。为确认携带GFP报告基因的重组逆转录病毒载体RCASBP.B-MSTN-GFP的表达效率，同时还构建了不含GFP报告基因的重组逆转录病毒载体RCASBP.B-MSTN，结果显示这两个重组载体均能实现MSTN基因的表达，且两者的表达效率差异不显著(P＞0.05)，即携带GFP报告基因的重组逆转录病毒载体RCASBP.B-MSTN-GFP能够实现目的基因的高效过表达，可用于下一步目的基因的功能研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种携带GFP的鸭MSTN基因高效过表达逆转录病毒载体及其构建方法。所述的逆转录病毒载体可高效过表达鸭MSTN基因，为在鸭胚细胞及组织中全面研究MSTN基因在鸭肌肉发育、生长等方面的功提供生物材料。本专利技术通过以下技术方案实现：申请人根据含有GFP报告基因的pBI-EGFP载体序列，设计包含GFP基因的引物，并在上游引物起始密码子ATG前引入linker序列(GGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCAGGAGGAGGAGGATCA，可形成(Gly4Ser)3连接肽，既可以将两个蛋白分开，又不会影响两个蛋白的构象结构和功能发挥)和BamHⅠ(GGATCC)酶切识别位点及保护碱基，其DNA序列如SEQIDNO：1所示；下游引物终止密码子TAA后引入EcoRⅠ(GAATTC)酶切识别位点及保护碱基，其DNA序列如SEQIDNO：2所示。利用PCR方法扩增GFP基因片段，其序列如SEQIDNO：3所示，将PCR产物用BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切后，纯化酶切产物。将酶切获得的GFP基因片段插入穿梭载体本文档来自技高网...
【技术保护点】
包含有如SEQ ID NO：10所示的DNA片段的携带GFP报告基因的逆转录病毒载体在高效过表达鸭MSTN基因中的应用。
【技术特征摘要】
1.包含有如SEQIDNO：10所示的DNA片段的携带GFP报告基因的逆转录病毒载体在高效过表达鸭MSTN基因中的应用。2.一种携带有GFP报告基因的逆转录病毒载体RCASBP.B-MSTN-GFP在高效过表达鸭MSTN基因中的应用，其特征在于，所述的应用方法包括以下步骤：(1)根据GFP基因序列，设计在起始密码子前含有可形成连接肽Gly4Ser3的linker序列的上游引物及含有终止密码子的下游引物，该引物对的序列如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，利用PCR扩增得到核苷酸序列如SEQIDNO：3所示；(2)将步骤(1)扩增的序列插入穿梭载体pSlax-13中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒DNA并做双酶切鉴定，得到重组穿梭载体pSlax-13-GFP；(3)参考鸭MSTN基因mRNA序列，设计在起始密码子前含有可提高靶基因转录和翻译效率的Kozak序列的上游引物以及去除了终止密码子的下游引物对，该引物对的序列如SEQIDNO：5和SEQIDNO：6所示，利用PCR扩增得到如SEQIDNO：7所示的序列；(4)将步骤(3)扩增的序列插入步骤(2)构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚萍，杨永平，杨宇，叶胜强，王丽霞，邓兵，凌明湖，刘武，冉志平，周华，
申请(专利权)人：武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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