一种脂质体介导的细胞转染方法技术

本发明专利技术涉及一种脂质体介导的细胞转染方法，其包括以下步骤：S1：将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含0.5‑2μg/mL的纤粘蛋白；S2：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。通过在处理过程中使用纤粘蛋白可使细胞快速贴壁，从而无需将对细胞进行培养24个小时以达到要求的汇合度，因此，该方法减少了操作时间，简化了操作程序，降低了操作难度，同时降低了细胞被污染的风险。

Liposome mediated cell transfection method

The invention relates to a liposome mediated transfection method, which comprises the following steps: S1: containing cells in liquid culture medium inoculated with transfected vessel, the cell containing liquid medium containing 0.5 2 g/mL Fibronecin; S2: the mixture added DNA and liposome transfection transfection reagent to the transfection container were transfected. Through the use of fibronectin in the process of the rapid cell wall, which does not need to be cultured for 24 hours in order to achieve the required degree of confluence of cells, therefore, the method can reduce operation time, simplify the operation procedures, reduce the operation difficulty, while reducing the risk of contamination of cells.

【技术实现步骤摘要】
一种脂质体介导的细胞转染方法
本专利技术涉及细胞生物学领域，更特别地，涉及一种脂质体介导的细胞转染方法。
技术介绍
转染是将外源遗传物质转入到真核细胞内的一种专门技术，随着基因与蛋白功能研究的深入，转染已成为现代分子生物学研究中经常涉及的基本方法，它解决了外源遗传物质导入细胞的难题，为在细胞水平上进行基因功能研究奠定了基础。随着近年来基因工程技术的不断发展，出现了多种多样的转染技术，按外源遗传物质是否与基因组整合来分，转染技术分为瞬时转染和稳定转染两大类；按转染实施手段来分，转染技术分为物理介导、化学介导和生物介导三大类。常见的转染方法有显微注射、电穿孔、基因枪、光学转染、DEAE-葡聚糖法、磷酸钙法、人工脂质体法等。转染技术的选择会影响细胞转染效率，进而影响到整个实验结果。因此在进行细胞转染前，需对转染过程中涉及的因素进行综合分析，以便筛选出针对特定细胞转染的最适方法和条件。阳离子脂质体转染法具有操作简单，转染成功率高，对细胞类型的应用面广，可以转染DNA、RNA、寡核苷酸以及蛋白质、病毒等多种类型，可以负载大片段DNA等优点，既可用于瞬时转染，也可用于永久表达系的建立；既可用于细胞转染，也可用于体内的基因转染，现广泛用于人、大鼠、小鼠、兔、猪、马、牛、羊、鸡、鸭等动物细胞系或体内细胞的瞬时或稳定转染。脂质体也称人工细胞膜，是由脂质双分子层组成，磷脂分子在水中可自动生成闭合的双层膜，从而形成一种囊状物被称为脂质小体。最初人们只是运用脂质体模拟膜的构造及其功能，从而发现了膜的融合及内吞作用。脂质体介导转染的基本原理是细胞通过胞饮将脂质体/DNA复合物摄入胞浆中，阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根(PO4-3)通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA—脂质体复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞作用偶尔也通过渗透作用，将DNA传递进入细胞形成包涵体或进入溶酶体。内吞后的DNA—脂质体复合体在细胞内形成的包涵体，在辅助脂质体DOPE作用下，细胞膜上的阴离子脂质因膜的去稳定而失去原有的平衡，扩散进入复合体，与阳离子脂质中的阳离子形成中性离子对，使原来与脂质体结合的游离出来进入细胞质，进而通过核孔进入细胞核，最终进行转录并表达。目前常用的脂质体或脂质体复合物转染试剂有Lipofectamine2000(Invitrogen)、FuGENE6(Roche)、EffecteneTransfectionReagent(Qiagen)及国产的LipoFiter转染试剂(汉恒生物)、TransLipidTransfectionReagent(全式金)、Lipo6000TransfectionReagent(碧云天)等。这些试剂说明书中均说明在转染时细胞汇合度达到70％-90％或50％-80％、40％-80％、50％-70％等时，按照推荐的比例进行转染，即可达到理想的效果。但在实际实验中发现，在转染前一天将细胞传代至6孔板或12孔板，18-24h后，有个别或多个孔的细胞汇合度不在说明书要求的范围内，特别是对于不经常做细胞培养的“新手”来说，如何准确判断细胞汇合度达到70％-90％，也是个问题。当细胞汇合度达不到说明书的推荐要求时，又要重新培养细胞，耽误时间；或者有个别孔的细胞汇合度不在说明书要求的范围内，匆匆进行转染，既达不到实验效果，又浪费试剂，浪费时间。此外，长时间的培养会增加培养细胞被污染的风险。然而，如果转染前细胞生长时间过短，细胞就不能很好地黏附于培养皿上，与脂质体接触后，细胞容易脱落而逐渐死亡。因此，需要一种无需长时间培养细胞即可进行脂质体转染的方法。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种脂质体介导的细胞转染方法，其包括以下步骤：S1：将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含0.5-2μg/mL的纤粘蛋白；S2：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。通过在处理过程中使用纤粘蛋白可使细胞快速贴壁，从而无需将对细胞进行培养24个小时以达到要求的汇合度，因此，该方法减少了操作时间，简化了操作程序，降低了操作难度，同时降低了细胞被污染的风险。在一个实施方案中，S1中细胞的接种浓度为1-2×106个/mL。控制细胞的接种浓度使得转染过程中有足够的被转染的细胞存活下来，同时又不会因为细胞太密集而发生接触抑制的现象。在另一个实施方案中，所述液体培养基为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。在另一个实施方案中，S2具体包括：S21：将所述转染DNA与脂质体转染试剂混匀，于室温下静置20分钟，得到转染DNA与脂质体转染试剂的混合液；S22：将所述转染DNA与脂质体转染试剂的混合液加入到装有包含细胞的液体培养基的转染孔中，混匀；S23：细胞于37℃下培养12-18小时；S24：更换新鲜的含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基培养基，即得到转染好的细胞。在另一个实施方案中，S21中转染DNA为质粒DNA，脂质体转染试剂为Lipofectamine2000、TransLipidHL。附图说明图1是采用本专利技术方法转染pEGFP-C1的DF-1细胞在白光和GFP激发光下显微照片，显微观察倍数均为×100；图2是采用本专利技术方法使用TransLipidHL转染试剂转染GFP过表达逆转录病毒载体的DF-1细胞在GFP激发光下的荧光显微照片；图3是采用本专利技术方法转染shRNA逆转录病毒载体的DF-1细胞在RFP激发光下的荧光显微照片。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.转染的步骤如下：将细胞接种至37℃预热的6孔板中，细胞培养液为含10％胎牛血清、1μg/mL纤粘蛋白(购自Gibco公司)的DMEM高糖培养基(购自Gibco公司)，然后将转染DNA和转染试剂混合后加入6孔板中进行转染，37℃培养后后更换新鲜的细胞培养液。结果表明，该细胞转染方法可获得较好的转染效果，与常规转染方法相比，可省去转染前的约24h的细胞培养时间，并无须判断细胞汇合度是否达到转染要求，大大提高了实验效率。2.实验条件优化1)纤粘蛋白添加量的优化将接种浓度为1.2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的12孔板中，细胞培养液分别为含10％胎牛血清+0.1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基、10％胎牛血清+0.5μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基、10％胎牛血清+1μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基、10％胎牛血清+2μg/mL纤粘蛋白的DMEM高糖培养基，纤粘蛋白每个添加量设置3个重复。将2μgpEGFP-C1质粒(一种表达绿色荧光蛋白的真核表达载体，由实验室保存)与4μLLipofectamine2000(购自Invitrogen公司)按照说明书步骤孵育混合后加入12孔板中进行转染，12h后更换新鲜细胞培养液，并在不同时间显微观察细胞生长状况.结果表明，0.5-2μg/mL的纤粘蛋白都能实现良好的转染效果，其中1μg/mL纤粘蛋白可获得最好的转染效果。2)细胞接种浓度的优化分别将接种浓度为2×105、5×105、1.2×106和2×106的DF-1细胞接种至37℃预热的12孔板中，将本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂质体介导的细胞转染方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含0.5‑2μg/mL的纤粘蛋白；S2：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。

【技术特征摘要】
1.一种脂质体介导的细胞转染方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：将包含细胞的液体培养基接种于转染容器中，所述包含细胞的液体培养基中包含0.5-2μg/mL的纤粘蛋白；S2：向所述转染容器中添加转染DNA和脂质体转染试剂的混合液进行转染。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1中细胞的接种浓度为1-2×106个/mL。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，S2具...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚萍，杨永平，杨宇，叶胜强，王丽霞，邓兵，凌明湖，刘武，钱运国，周华，
申请(专利权)人：武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42