本发明专利技术涉及一种表达绿色荧光蛋白的哺乳动物肿瘤细胞系EA‑GFP的制备方法和应用，该细胞系与亲本细胞系相比具有类似的生长曲线，在细胞迁移实验中，HGF引起的细胞迁移效应显著，小分子特异性抑制剂对HGF引起的细胞迁移效应抑制效应显著，以上生物学活性与亲本细胞系一致。本发明专利技术制备的细胞模型，是将绿色荧光蛋白（GFP）基因通过慢病毒感染的方式插入哺乳动物肿瘤细胞系的基因组内，获得的稳定表达绿色荧光蛋白的细胞系，该细胞模型在细胞迁移实验中可以通过直接荧光显微镜观察的方式来显示实验结果，简化了该细胞模型应用于高通量药物筛选的步骤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物筛选领域，具体涉及一种表达绿色荧光蛋白的EA细胞系。
技术介绍
肿瘤已成为目前威胁人类健康的头号杀手，抗肿瘤药物的研发和肿瘤的临床治疗成为科研的热点，因此建立有效的抗肿瘤药物筛选模型刻不容缓，肿瘤本身特有的迁移性和侵袭性是肿瘤逃避机体免疫应答的重要机制，因此抑制肿瘤迁移性和侵袭性的药物备受人们关注。高通量药物筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的新的技术体系，它以分子水平和细胞水平的实验方法为基础，以微板形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对实验获得的数据进行分析处理。它的正常开展需要有一个高容量的化合物库、自动化的操作系统、高灵敏度的检测系统、高效率的数据处理系统以及高特异性的药物筛选模型。绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，简称GFP）的基因是从Aequorea victoria水母的基因组中提取获得的，蛋白全长238AA，其65-67氨基酸残基（丝氨酸—酪氨酸—甘氨酸）可自发的形成荧光发色团，在蓝色波长范围的光线激发下，可以发出绿色荧光，吸收光谱的最大峰值为395nm，发射光谱最大峰值为509nm。如今GFP已作为报告基因被广泛应用于免疫学，神经生物学，遗传学，器官移植等各个领域。而在肿瘤相关的基础研究和药物研发领域，GFP也发挥了极大的作用。目前在真核细胞转染和稳定细胞株构建领域，病毒载体正越来越受到重视。目前常用的病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体和逆转录病毒载体等，其中逆转录病毒中的慢病毒载体因其表达的稳定性，包装容量大以及能够实现多基因共感染等优势被广泛使用于科研中。慢病毒感染能够将目的基因整合入细胞的基因组，所以不用再培养基中加入筛选压力就能稳定表达目的蛋白，大大简化了实验过程，降低了成本。目前使用的慢病毒包装体系是由HIV病毒的基因组改造而成的。使用最广泛的为第三代慢病毒，是一种三质粒系统，能用于感染非分裂期的细胞。通过改造去除了不相关基因序列，并使用异源的部分基因代替同源基因（如：envelope-coding质粒）来增加其安全性，同时对启动子等序列进行修饰改造提高了病毒滴度和转染效率。最后通过改造得到了自身失活型慢病毒载体（self-inactivation, SIN）有着较高的滴度，转染效率和安全性。而病毒获得后除了能用于细胞的感染外，也能用于基因治疗。EA细胞全称为EA.hy926，A549细胞和HUVEC细胞融合而成的血管上皮细胞株，是研究肿瘤增殖、迁移和血管生成的常用细胞系。本专利技术使用慢病毒系统包装绿色荧光蛋白（GFP）基因，通过慢病毒感染EA细胞，获得稳定表达GFP的EA细胞株。这一细胞株的建立大大简化了体外药物筛选的检测手段，同时可以应用于药物对动物肿瘤模型的疗效方面的研究，实现肿瘤大小和分布的实时监控和数据收集。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种能高通量筛选抗细胞迁移药物的细胞模型。解决本专利技术技术问题的技术方案为：一种筛选抗细胞迁移药物的细胞模型，是通过慢病毒将绿色荧光蛋白基因转入到EA细胞系的基因组内，获得的稳定表达绿色荧光蛋白的EA细胞株。其中，上述细胞模型中的GFP基因能够稳定表达，其中，上述细胞模型中的GFP序列为SEQ ID NO:1。本专利技术还提供了一种制备上述筛选抗细胞迁移药物细胞模型的方法，该方法包括以下步骤：将GFP基因克隆至prrl质粒内，构建成prrl-CMV-GFP重组质粒，将该质粒和慢病毒包装质粒共转染对数期的293T细胞，收获纯化病毒，病毒感染对数期EA细胞，经有限稀释法和荧光筛选，获得本专利技术所述的细胞模型。本专利技术还提供了一种抗细胞迁移药物的筛选方法，该方法包括以下步骤：a．取上述的用于筛选抗细胞迁移药物的EA细胞模型接种于transwell小室的上室，筛选组的上室加入含待筛选物的维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阳性对照组上室为维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阴性对照组上室和下室均为维持培养基；b．培养各组细胞，计数各组迁移细胞数量，根据细胞迁移数的多少确定待筛选物是否为需要的潜在药物；进一步的，上述的抗细胞迁移药物筛选方法的细胞迁移数为从上室迁移至下室的细胞数量。根据本专利技术的第一个方面，在仔细分析不同感染技术的基础上，选择慢病毒包装系统来制备稳定表达绿色荧光蛋白的EA细胞株。本专利技术细胞模型中含有整合到基因组上的GFP基因的编码序列，且该序列能够稳定表达。该细胞模型通过检测荧光信号来直接进行细胞计数，简化了细胞迁移实验的步骤和流程，为实现抗细胞迁移药物高通量筛选奠定基础。根据本专利技术的第二个方面，建立了制备上述筛选抗细胞迁移药物的细胞模型的方法。该方法具体可通过以下步骤实施：将EA细胞培养至对数生长期；将装载有GFP基因的慢病毒在polybrene的介导下感染EA细胞；经有限稀释法和荧光显微镜筛选得到本细胞模型。根据本专利技术的第三个方面，建立起了以本专利技术细胞模型为基础的抗细胞迁移药物筛选方法，步骤如下：a．取上述的用于筛选的细胞模型接种于transwell小室内，细胞接种数目为5×104/孔。分组为筛选组、阳性对照组和阴性对照组。其中筛选组的上室加入含待筛选物的维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阳性对照组上室为维持培养基，下室加入含HGF的维持培养基；阴性对照组上室和下室均为维持培养基；b.细胞孵育24h，细胞固定后，无菌棉签擦掉上室细胞，荧光显微镜下计数小室下表面4个固定视野区域的迁移细胞总数，根据迁移细胞数量确定待筛选物是否为需要的潜在药物；其中，上述方法步骤a中加入的HGF的用量为12.5ng/ml-200ng/ml，优选为100ng/ml。本专利技术中涉及的常规细胞培养及常规分子生物学的试验操作，都是本领域普通技术人员参考现有的相关试验指南或仪器、试剂的使用说明能够完成的。本专利技术的有益效果在于：本专利技术细胞模型通过荧光显微镜可以直接观察迁移细胞数，能够高通量、高灵敏的准确筛选抗细胞迁移药物；本专利技术细胞模型的制备方法简单可控，成本低廉；本专利技术抗细胞迁移药物筛选方法步骤简单，成本低廉，准确性高，可实现高通量的筛选，具有很好的稳定性和可靠性。为抗细胞迁移药物的筛选提供了新的思路，具有很好的市场前景。附图说明图1：prrl-CMV-GFP重组质粒的酶切电泳图。图2：EA-GFP细胞系稳定性分析。其中第1代和第30代分别指第1代和第30代EA-GFP细胞系，明场是指明场下细胞照片，荧光场是指荧光场下细胞照片。图3：EA-GFP细胞系与野生型EA细胞系生长曲线比较。其中横坐标为细胞生长时间（培养时间），纵坐标为450nm单波长条件下测定的光度吸收值（波长450nm）。图4：EA-GFP细胞系与野生型EA细胞系在HGF作用下细胞迁移结果分辨率；A为明场条件下HGF作用下EA-GFP细胞系迁移照片；B为荧光场条件下HGF作用下EA-GFP细胞系迁移照片，A与B为同一区域不同光场下照片；C为荧光场条件下无HGF作用下EA-GFP细胞系迁移照片；D为明场下野生型EA细胞系在HGF作用下细胞迁移照片（经结晶紫染色）；B与A比较，细胞分辨率明显升高，B与D比较，细胞分辨率没有显本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测人源性BAX基因表达水平的特异性引物组合，该组合包含以下引物序列：BAX基因检测的引物组合：上游引物F‑bax：CGGGTTGTCGCCCTTTTCTA下游引物R‑bax：GTCCAATGTCCAGCCCATGARPL19内参基因检测的引物组合：上游引物F‑rpl：CGAGCGAGCTCTTTCCTTT下游引物R‑rpl：AGACCTTCTTCTTGCCACAGC。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测人源性BAX基因表达水平的特异性引物组合，该组合包含以下引物序列：BAX基因检测的引物组合：上游引物F-bax：CGGGTTGTCGCCCTTTTCTA下游引物R-bax：GTCCAATGTCCAGCCCATGARPL19内参基因检测的引物组合：上游引物F-rpl：CGAGCGAGCTCTTTCCTTT下游引物R-rpl：AGACCTTCTTCTTGCC...
【专利技术属性】
技术研发人员：蒋明，蒋韵，尹衍新，刘敏亚，
申请(专利权)人：同济大学苏州研究院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。