本发明专利技术涉及一种表达牛干扰素（α、β或γ－干扰素）的重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗。本发明专利技术还公开了制备所述重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗的方法和该重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗在制备牛α、β或γ－干扰素中的应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及重组病毒疫苗领域，更具体地，本专利技术涉及一种表达牛干扰素(a、 P 或丫-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。本专利技术还公开了制备所述重组新城疫 LaSota弱毒疫苗的方法和该重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛a、 |3或Y-干扰素中 的应用。
技术介绍
牛干扰素(Bo IFN )基因分为I型和II型，其中I型干扰素又可分为a、 p、 co、 t 四个类型，均为无内含子的单拷贝或多拷贝基因。干扰素以其广谱的抗病毒活性、抑 制细胞分化和增殖及广泛的免疫调节能力决定了其具有巨大的应用潜力，可用来预防 和治疗病毒性疾病、寄生虫病等。随着DNA重组技术的发展，人工大量生产干扰素 已成为可能，从而大大降低了干扰素生产成本，增加了利用重组牛干扰素治疗牛病的 可能性。牛干扰素的研究始于80年代中期,Velan等(1985)最先以人IFN-a基因为探 针从牛的cDNA文库中克隆了牛IFN-tx基因,从此广泛展开了对牛IFN生物学功能的 研究。20世纪80年代末，随着基因工程技术的发展,重组干扰素被广泛使用。国内外 对动物干扰素进行了深入的研究,目前已克隆了猪、狗、鸡等动物的多种干扰素基因, 部分重组产品已应用于临床。研究报道体外表达的BoIFN蛋白可以抗水泡性口炎病毒、 ,口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、呼吸道合胞体病毒、副流感以及非洲猪瘟等病毒的 增殖和复制[2~71。大肠杆菌表达系统己广泛用于制备人和动物干扰素，所表达的重组蛋白在体内外 具有明显的抗病毒活性^1，但大肠杆菌表达的蛋白经尿素溶解、变性后复性率低。 而且成本高，不便于大规模生产。毕赤酵母和杆状病毒表达系统是近年来发展起来的 真核表达系统，表达的外源蛋白可以获得正确折叠和糖基化，但两种表达系统同 样存在成本高、纯化困难的缺点。新近发展起来的新城疫活病毒载体系统，使表达的 外源蛋白接近天然状态，无需纯化，成本低廉，利于大规模生产有生物活性的外源蛋 白。负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA 制造新病毒的过程，其基本过程是①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA 克隆，5，末端精确地缀于T7启动子后，3'末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7 转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动 病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子) 一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞； ◎24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向 遗传操作系统(reverse genetic system, RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链 RNA病毒。申请人之前获得授权的中国专利"新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应 用，，(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota 弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展 新城疫病毒活载体疫苗研制及重组新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)相关基础奠定了坚实的基础。
技术实现思路
基于重组牛千扰素在治疗牛病毒性疾病和寄生虫病方面广阔的应用前景，本专利技术 人在已建立的新城疫病毒LaSota疫苗株反向遗传操作系统的基础上，构建了表达牛a、 P、 Y干扰素基因的全基因组克隆，实现了牛a、 P、 Y干扰素在SPF鸡胚内高效、稳定 表达，并对其表达产物进行了抗病毒活性研究。因此，本专利技术的一个目的是提供以下各项1. 一种表达编码牛干扰素的基因的重组新城疫LaSota弱毒疫苗。2. 根据以上l的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其中所述牛干扰素是牛a、 p或Y-干扰素(优选所述牛a、 p或丫-干扰素的氨基酸序列分别如SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示，更优选编码所述牛a、 p或？干扰素的基因如SEQ ID No. 4、 SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示)。3. 根据以上1的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，其为rLBoIFN-a, rLBoIFN-|3或 rLBoIFN-y。4. 根据以上l-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗在制备牛干扰素中的应 用。5. —种生产以上1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗的方法，该方法包括(1) 构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码牛干扰素的基因的所述新城疫 LaSota弱毒疫苗的基因组cDNA序列；(2) 构建一个或多个转录辅助质粒，该辅助质粒包括编码所述新城疫LaSota弱 毒疫苗的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫LaSota弱毒疫苗的大聚合酶蛋白(L)的cDNA 序列；(3) 将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫LaSota弱毒疫苗复制许 可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；(4) 收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。6. 根据以上5的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-BoIFNa、pBRN-FL-BoIFN卩 或pBRN-FL-BoIFNy (基因序列分别见SEQ ID No. 7、 SEQ ID No. 8、 SEQ ID No. 9， 质粒图谱分别见图5-7)。7. 根据以上5的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、 pBSP和pBSL。8. 根据以上5-7中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。9. 根据以上5-7中任何一项的方法制备的重组新城疫LaSota弱毒疫苗，优选为 rLBoIFN-a, rLBoIFN-(3或rLBoIFN-丫。10. —种生产牛干扰素的方法，该方法包括1) 将根据以上1-3中任何一项的重组新城疫LaSota弱毒疫苗接种敏感细胞或接 种鸡胚尿囊腔；2) 收获细胞上清液或鸡胚尿囊液。该方法还可以任选地包括常规干扰素纯化步骤。本专利技术利用新城疫病毒LaSota株作为表达载体，分别构建表达牛oi、 p、 Y-干扰素 (Bovine interferon-a, Bovine interferon-卩,Bovine interferon-^)完整开方文阅读框的全基 因组质粒pBRN-FL-BoIFNa、 pBRN-FL-BoIFN|3、禾Q pBRN-FL-BoIFNy,转染BHK-21 细胞获得表达BoIFN-ou (3、 Y的重组新城疫病毒。采用RT-PCR方法，证实收获的鸡 胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因。将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城 疫病毒，利用重组病毒VSV-GFP在MDBK细胞系上测定rLBoIFN-a, rLBoIFN-卩,rLBoIFN-Y抗病毒活性，表达BoIFN的重组新城疫病毒均能有效抑制水疱性口炎病毒 (VSV)在牛肾细胞(MDBK)上的复制，rLBoIFN-a、 rLBoIFN-|3、 rLBoIFN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达编码牛干扰素的基因的重组新城疫ＬａＳｏｔａ弱毒疫苗。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：步志高，葛金英，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]
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