一种制备猪α-干扰素的方法技术

本发明专利技术提供一种制备猪α－干扰素的方法，通过目的基因克隆、构建芽孢杆菌表达载体、克隆启动子和信号肽序列并研究其对外源基因表达和分泌的影响，从而构建高效分泌型芽孢杆菌表达系统。通过改进猪α－干扰素基因工程菌发酵条件，提高其表达量；在复性液中添加与盐酸胍有相似结构的精氨酸，促进蛋白质溶解，不影响蛋白质活性，来提高猪α－干扰素的比活性，从而生产出具有高效、价廉、安全、无潜在病毒污染、稳定性高、单位体积活性效价高等优点的猪α－干扰素，本发明专利技术设计合理，适于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，涉及用高分泌型枯草芽孢杆菌表达系统制 备猪a-干扰素的方法。
技术介绍
干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而 主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复 制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的 活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力，替代部分抗生素的使 用。1966—1971年，Friedman发现了干扰素的抗病毒机制，而后，千扰 素的免疫调控及抗病毒作用、抗增殖作用以及抗肿瘤作用逐渐被人们认 识。猪ot-干扰素基因有2个亚型，至少有17个亚种，定位于猪的l号染 色体上，目前只有部分被测序和表达。猪a-干扰素是由10多个相关功能基因编码的蛋白质家族，与猪-co干 扰素亚型之间有高度的同源性。猪a-干扰素的全基因为570bp，编码189 个氨基酸，其中诱导分泌表达的信号肽由23个氨基酸组成，猪a-干扰素 无内含子。早在1986年，Lefevre等得到了一个含a-干扰素基因的片段， 序列分析表明其中有一连续的含190个密码子的开放阅读框，起始密码子 上游有约IOO个核苷酸的5'区域，具TATTTAA序列，被认为是经修饰 的HognessGoldberg盒。此基因编码的成熟猪a-干扰素的70-80位氨基酸 有一个潜在的N-糖基化位点。此基因与人IFN-al核苷酸的编码序列有 78.5。/。同源，编码的氨基酸与人IFN-al有64M同源，是所有已知动物IFN-(x 基因中与人类IFN-a基因同源性最高的。随着猪干扰素基因的克隆成功， 对其重组产物的临床应用及作用机理的研究也随之展开。1990年，Lefevre 等人在大肠杆菌中表达了 IFN-a基因，得到了一个含189个氨基酸的前体 蛋白，去除其N端的含23个氨基酸的信号肽后，得到了具有完全天然 IFN-a生物学活性的产物，并且其在猪源性细胞上的抗病毒活性至少是病 毒刺激猪白细胞产生的干扰素的6倍。重组猪a-干扰素的抗病毒能力是后续研究的一个热点，如对伪狂犬病毒(Jan et al,1991)、水泡性口膜炎 病毒、流感病毒(Horisberger，1992)、传染性胃肠炎病毒(Jordan et al,1994)、 猪呼吸与繁殖综合症病毒(Albina et al， 1998)和口蹄疫病毒(Chinsangaram et al,2001)等。国内对猪(x-干扰素的研究也比较早，刘万钧等(1998 )用 Vero传代细胞对猪流行性腹泻病毒(PEDV)进行干扰试验，证明猪白细胞 干扰素能有效地抑制PEDV的繁殖活性，在IFN剂量为100U/ml时可明 显抑制，1000U/ml可显著抑制，2500U/ml几乎可完全抑制。其它研究人 员对猪-a干扰素基因进行了克隆和表达，并获得了具有抗病毒活性重组 蛋白，陈涛(2002)将克隆的猪a-干扰素基因进行了定点突变，第86位 的CyS突变为Tyr，同时将N端首位氨基酸(CyS)的密码子TGT同义突变 为大肠杆菌偏爱的密码子TGC，并将在大肠杆菌BL21中表达，获得的重 组蛋白比未突变的重组蛋白抗病毒能力有所提高。谢海燕等(2004)在大 肠杆菌BL21 (DE3)中对猪a-干扰素进行了融合表达，经western-blotting 检测，重组融合蛋白具有良好的反应源性；猪干扰素是一类具有抗病毒和 免疫调节活性的细胞因子，是猪体抵御病原入侵的重要早期防御系统之 一。应用基因工程的方法通过大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母和哺乳动物 细胞表达系统等表达的重组猪干扰素可以具有与天然干扰素高度相似甚 至更高的抗病毒等生物学活性。因此，作为一类具有高效的抗病毒和免疫 调节作用的生物制剂，重组猪a-干扰素在养猪业有广泛的应用前景。1980-1982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获 得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫升干扰素。从1987 年开始，使用基因工程方法生产干扰素。但目前的猪a-干扰素存在着稳定 性差、产品活性低等难题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备猪a-干扰素的方法，通过以下技术方案实现(1)设计一对在大肠杆菌中表达猪a-干扰素成熟肽基因的表达引物，克隆猪 a-干扰素成熟肽基因，得到重组质粒；SEQNOh 5Eifn5，-TAGAATTCTGCAACCTGCCTCAGACCCA-3'SEQ NO 2: 3Eifn5，-GCGGCCGCTCACTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCT-3'胸I猪a-干扰素基因序列见SEQ NO 3。(2) 载体构建将重组质粒和表达载体用五COl和^"I进行双酶切，回收酶切片段，与表达载体连接，转化，筛选阳性质粒，然后进行PCR和酶切 鉴定；(3) 猪a-干扰素在枯草芽孢杆菌中的表达制备芽孢杆菌感受态细胞， 将重组质粒经过点击转化导入其中，作进一步培养，并抽提质粒后进行和^d双酶切检验；(4) 重组工程菌的蛋白电泳菌液上清进行浓縮，用银染对SDS-PAGE 进行染色；(5) 猪a-干扰素标的产物产量和活性的研究；(6) 菌种制备将猪a-干扰素基因工程菌菌株接种到含氨苄青霉素钠的 LB液体培养基中培养，将菌液接种于发酵罐中，温度3(TC， pH为7.0，搅拌速 度200-220rpm，培养6小时后增温至45"C诱导，猪a-干扰素开始表达，至28小时 表达量达到最大值，在此期间质粒稳定性良好；(7) 获得产品离心收集菌体，用缓冲液冲洗菌体，冰浴超声破碎，取 上清液，收集包涵体沉淀，用洗涤液洗涤，取上清液，加入复性液，调节pH 用复性液透析，取上清液浓縮；(8) 产品纯化利用DEAE阴离子交换纤维柱梯度洗脱，收集含猪a-干扰 素的洗脱液，超滤浓縮，得到产品。本专利技术提供的方法，不仅提高猪a-干扰素的稳定性，降低其生产成本， 提高其生产效率，而且能提高猪a-干扰素的单位体积的活性。具体体现在(1) 构建的载体整合到芽孢杆菌中，十分稳定，不易丢失。(2) 发酵初期采用不含甲醇的LB培养基，培养后期采用1.0%甲醇诱导 培养基培养，使芽孢杆菌的生长和蛋白表达有效分开，从而使得干扰素表达量 可维持在较高的水平，不易分解。(3) 本专利技术是一种用高分泌型枯草芽孢杆菌表达系统生产猪a -干扰素的 新工艺，这种新工艺通过目的基因克隆、构建芽孢杆菌表达载体、克隆启动子 和信号肽序列并研究其对外源基因表达和分泌的影响，从而构建构建高效分泌 型芽孢杆菌表达系统。通过改进猪a-干扰素基因工程菌发酵条件，提高其表 达量；在复性液中添加与盐酸胍有相似结构的精氨酸，促进蛋白质溶解，不影 响蛋白质活性，来提高猪a-干扰素的比活性。从而生产出具有高效、价廉、安全、无潜在病毒污染、稳定性高、单位体积活性效价高等优点的猪C-干扰 素，这为工业化生产猪a-干扰素，并应用于我国的养猪事业奠定了基础。附图说明图1为基因克隆示意图。图2为猪a干扰素基因PCR扩增电泳。 图3为猪a-干扰素基因在枯草芽孢杆菌中的表达。 图4为含有限制性酶切位点Sa/I和^^1的PoIFN基因扩增。 图5为枯草杆菌阳性表达子的双酶切产物电泳。 图6为猪a-干扰素基因在枯草杆菌中表达产物的蛋白质电泳。 具体实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备猪α－干扰素的方法，通过以下技术方案实现：　（１）设计一对在大肠杆菌中表达猪α－干扰素成熟肽基因的表达引物，在上、下游引物的５’端分别引入ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切位点序列；　（２）载体构建：将重组质粒和表达载体用ＥｃｏＩ 和ＸｂａＩ进行双酶切，回收酶切片段，与表达载体连接，转化，筛选阳性质粒，然后进行ＰＣＲ和酶切鉴定；　（３）猪α－干扰素在枯草芽孢杆菌中的表达：制备芽孢杆菌感受态细胞，将重组质粒经过点击转化导入其中，作进一步培养，并抽提质粒后进行Ｓａｌ Ｉ和ＸｂａＩ双酶切检验；　（４）重组工程菌的蛋白电泳：菌液上清进行浓缩，用银染对ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行染色；　（５）猪α－干扰素标的产物产量和活性的研究；　（６）菌种制备：将猪α－干扰素基因工程菌菌株接种到含氨苄青霉素钠的Ｌ Ｂ液体培养基中培养，将菌液接种于发酵罐中，温度３０℃，ｐＨ为７．０，搅拌速度２００－２２０ｒｐｍ，培养６小时后增温至４５℃诱导，猪α－干扰素开始表达，至２８小时表达量达到最大值，在此期间质粒稳定性良好；　（７）获得产品：离心收集菌体， 用缓冲液冲洗菌体，冰浴超声破碎，取上清液，收集包涵体沉淀，用洗涤液洗涤，取上清液，加入复性液，调节ｐＨ用复性液透析，取上清液浓缩；　（８）产品纯化：利用ＤＥＡＥ阴离子交换纤维柱梯度洗脱，收集含猪α－干扰素的洗脱液，超滤浓缩，得到产品。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：余东游，姜礼辉，刘韶娜，陈伟东，
申请(专利权)人：浙江大学，杭州万得富生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]