一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体公开了一种表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌及其构建方法和应用。本发明专利技术的表达可溶性猪γ-干扰素PoIFN-γ的基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ和质粒pTf16-ParaB-tig的大肠杆菌BL21(DE3)。其中，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-γ中的PoIFN-γ基因序列是SEQ?ID?NO.4；所述质粒pTf16-ParaB-tig可表达分子伴侣tig。本发明专利技术方法提高了猪γ-干扰素的可溶性及产量，工艺简单且成本低，具有良好的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达可溶性猪Y -干扰素PoIFN- Y的基因工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
猪Y-干扰素(porcine interferon gamma, PoIFN- Y )也称猪 II 型干扰素，是一类由活化的T淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞等分泌的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤、激活淋巴细胞和免疫调节等功能。实际应用中，将猪干扰素作为疫苗佐剂，与治疗不同疾病的疫苗联合使用，研制出免疫效果更好的新型疫苗，对猪病防治具有积极的影响。目前猪干扰素的批量生产主要有细胞诱导培养法和以毕赤酵母、大肠杆菌为表达系统的基因重组法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂，成本高，且产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。以毕赤酵母为表达系统的基因重组法虽较前一种先进，生产成本大大降低，但其工艺还是相对较复杂且表达量有限。而以大肠杆菌为表达系统的基因重组法，虽能提高其表达量，但产物为无活性的包涵体，需经繁琐低效、代价昂贵的复性过程才能获得生物学功能。因此，如何获得高表达量的活性猪Y-干扰素成为近年来学者们广为研究的热点。本专利技术克服了上述现有技术制备猪Y-干扰素表达量低、产物为无活性包涵体、制备工艺复杂繁琐等缺陷，提出了一种表达可溶性猪Y-干扰素的基因工程菌及其构建方法，以及利用该基因工程菌进行猪Y-干扰素的高效制备方法；通过采用自诱导培养基发酵表达猪Y-干扰素，省去了监测菌体密度和添加IPTG诱导剂等步骤，使操作简洁易行，同时避免了 IPTG对菌体的毒害作用。利用本专利技术方法制备猪Y-干扰素，成本低、易操作、产量高且活性好。
技术实现思路
本专利技术提出一种表达可溶性猪Y-干扰素PoIFN-Y的基因工程菌，所述基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-Y和质粒pTf 16-PaMB_tig的大肠杆菌BL21(DE3) ο其中，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-Y中的PoIFNi基因序列是SEQ IDN0.4 ;所述质粒pTfl6-PaMB-tig可表达分子伴侣tig。其中，所述PoIFN-Y基因(SEQ ID N0.4)的5'端为SEQ ID N0.2 (含肠激酶和KpnI酶切位点)，3'端为SEQ ID N0.3 (含终止密码子和BamHI酶切位点)，中间为经优化的猪Y-干扰素成熟肽基因(SEQ ID N0.1)。本专利技术还提出了所述基因工程菌的构建方法，其步骤为:将所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN- Y和质粒pTf 16-PaMB_tig分别转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到所述基因工程菌。 其中，所述重组质粒pET_32a(+)-PoIFN-Y的构建方法为:首先人工合成所述PoIFN-y 基因(SEQ ID N0.4)，用 KpnI/BamHI 对所述 PoIFN-γ 基因(SEQ ID N0.4)和质粒pET_32a(+)进行双酶切，连接、转化大肠杆菌DH5a，再挑取重组子并提取得到所述重组质粒pET-32a (+) -PoIFN- Y。所述重组质粒pET_32a (+) -PoIFN- Y经测序鉴定，证实其含有所述 PoIFN-Y 基因(SEQ ID N0.4)。本专利技术还提供一种应用所述基因工程菌制备可溶性猪Y-干扰素PoIFN-Y的方法，其步骤为:将所述表达可溶性猪Y-干扰素的基因工程菌于LB液体培养基中进行培养后，转接入自诱导培养基继续培养，然后离心收集菌体；重悬所述菌体，搅拌过夜后，将其超声破碎并离心收集上清，经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩得到纯化的猪Y -干扰素融合蛋白，将其酶解后再次经镍离子亲和层析并脱盐、浓缩，得到所述猪Y-干扰素。其中，所述自诱导培养基的配方为:甘油0.1-2% v/v、胰蛋白胨0.1-2% w/v,酵母提取物 0.1-2 % w/v,乳糖 0.1-2 % w/v,葡萄糖 0.01-0.2 % w/v, NaCl0.1-2 % w/v,Na2HP045-100mM, KH2P045-100mM, (NH4) 2S045-100mM, MgS04l_20mM。其中，所述菌体的重悬使用破菌缓冲液，其配方为:Trisl0-100mM、溶菌酶0.01-0.2% w/v、TritonX-1000.1-1 % v/v。本专利技术还提供了一种用于治疗猪病毒性疾病的组合物，其含有有效量的可溶性猪Y-干扰素，以及药学可接受成分。本专利技术的目的在于构建一种表达可溶性猪Y -干扰素的基因工程菌，用于生产可溶性且成本低的猪Y-干扰素。本专利技术要解决的一个技术问题是构建一种可溶性表达猪Y-干扰素的基因工程菌。其特征在于，该基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-Y和质粒pTfl6-ParaB-tig 的大肠杆菌 BL21 (DE3)。所述的基因工程 菌的进一步特征在于，所述的重组质粒是pET_32a(+)-PoIFN- Y，能够高效表达猪Y-干扰素，其中，PoIFN-Y基因具有如下本专利技术设计的SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达可溶性猪γ?干扰素PoIFN?γ的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是同时携带重组质粒pET?32a(+)?PoIFN?γ和质粒pTf16?ParaB?tig的大肠杆菌BL21(DE3)。

【技术特征摘要】
1.一种表达可溶性猪Y-干扰素PoIFN-Y的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是同时携带重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-Y和质粒pTf 16-PaMB_tig的大肠杆菌BL21(DE3)。2.如权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN-Y中的PoIFN- Y基因序列是SEQ ID N0.4 ;所述质粒pTf 16_ParaB_tig可表达分子伴侣tig。3.如权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述PoIFN-Y基因(SEQID N0.4)的5'端为SEQ ID N0.2，3'端为SEQ ID N0.3，中间为猪Y-干扰素成熟肽基因(SEQ IDN0.1)。4.如权利要求1或2所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，其步骤为:将所述重组质粒pET-32a(+)-PoIFN- Y和质粒pTf 16-PaMB_tig分别转入大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到如权利要求1或2所述的基因工程菌。5.如权利要求4所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述重组质粒pET-32a(+) -PoIFN-y的构建方法为:首先人工合成所述PoIFN-Y基因(SEQ ID N0.4)，用KpnI/BamHI对所述PoIFN-Y基因(SEQ ID N0.4)和质粒pET_32a(+)进行双酶切，连接、转化大肠杆菌DH5 α，再挑取重组子并提取所述重组质粒pET_32a (+) -PoIFN- Y。6.如权利要求5所述基因工程菌的...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙谭，汪正华，吴自荣，郗洪生，王滨坤，
申请(专利权)人：江苏恒丰强生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：