本发明专利技术涉及一种在大肠杆菌中高可溶性表达并纯化屋尘螨主要过敏原Derp2蛋白的方法。本方法以大肠杆菌伴侣蛋白触发因子(Trigger Factor，TF)作为融合标签实现了Derp2的高可溶性表达并优化出高效的纯化工艺，用该方法获得的样品纯度高于98％。经验证，纯化的重组Derp2蛋白与天然提取的Derp2蛋白具有一致的二级结构折叠状态，并具有相同的屋尘螨过敏患者血清中特异性IgE结合活性。本发明专利技术所使用的融合表达方法能够实现Derp2蛋的可溶性表达，具有融合标签易于切除，重组蛋白表达量高，纯化工艺简单，适合于大规模工业化生产，产物保持天然活性的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种在大肠杆菌中高可溶性表达并纯化屋尘螨主要过敏原Derp2蛋白的方法。
技术介绍
过敏被定义为一种对环境中无害的物质即过敏原产生不利的免疫过度反应。过敏性疾病（也称为“特应性疾病”），如花粉症，过敏性支气管哮喘，过敏性皮炎，湿疹，荨麻疹，血管神经性水肿和过敏性反应，是全球性的健康问题，影响着超过全球25％的人口。自1960年以来，全球哮喘和过敏性鼻炎的患病率有着显著的上涨。过敏性疾病仍是最常见的慢性疾病，大大影响患者的健康和生活质量，加重了社会经济负担和医疗费用。室外和室内来源的很多物质均可能导致过敏。花粉是主要的室外过敏原，室内过敏原主要由屋尘螨，动物皮屑，蟑螂和真菌孢子组成。此外，一些常见的食品例如花生、坚果、大豆、牛奶、鱼虾等也含有已确定的过敏原成分。过敏原进入机体后，诱发B细胞产生IgE抗体，后者以其Fc段与靶细胞（肥大细胞、碱性粒细胞）表面IgE受体FcεRI结合。IgE一旦与靶细胞结合，机体即呈致敏状态。当相同的过敏原再次进入体内，与已结合在靶细胞表面的IgE发生特异性反应，导致其产生交联并引起FcεRI构象改变而聚集，激活下游通路，启动I型超敏反应相关的细胞因子、趋化因子和粘附分子等的合成和分泌，此过程即发敏阶段。靶细胞致敏后最终会引起脱颗粒并释放炎症介质的反应，这些炎症介质包括组胺、白三烯、血小板活化因子以及前列腺素D2等，能够导致毛细血管扩张、通透性增加、平滑肌收缩以及腺体分泌增多，引起全身反应、呼吸道反应、胃肠道反应以及皮肤反应。尽管人们对过敏性疾病的认识已经有久的历史，但现行的过敏性疾病诊断和治疗仍存在很大的局限性。目前常用的过敏原检测方式包过敏原皮肤试验、过敏原激发试验和血清特异性IgE抗体浓度测定等，这些方法主要使用过敏原的提取物作为抗原，把过敏原提取物用于诊断过敏性疾病准确性较高，但存在明显的问题如下：（1）过敏原提取成分复杂，含有蛋白质、糖类以及核酸等成分，难以实现标准化；（2）由于提取物中蛋白水解酶的存在导致过敏原的降解，或者降解产生不必要的有害物质带来稳定性问题；（3）难以在总提取物中检测少量的过敏分子；（4）难以检测患者是对单一物质过敏或是对一系列的不相关的物质过敏；（5）由于糖抗原表位交叉反应造成的假阳性；世界卫生组织（WHO）对过敏性疾病的治疗提出了包含避免接触过敏原、对症治疗、脱敏治疗、患者教育四个方面的综合性方案，作为过敏性疾病治疗的基本原则。2006年，欧洲变态反应与临床免疫学学会（EAACI）指出，脱敏治疗是唯一可能改变疾病自然进程的对因疗法，应该尽早使用，以防止受累器官的黏膜发生不可逆损伤。但是目前免疫治疗方法中使用的过敏原提取物存在比较明显的缺点：（1）无法确定粗提取物中各过敏原成分的具体量；（2）从各来源提取的过敏原不一致而且衡量过敏原提取物能力的单位也不一致；（3）提取物中主要过敏原量的变化导致过敏原成分的变化和过敏强度的不同；（4）给定的提取物中批次之间也有变化；（5）很难标准化有效的免疫治疗过敏原的量，尤其是提取物中的次要过敏原；（6）目前的免疫治疗在一些患者身上产生局部的、系统的、甚至致命的反应；鉴于过敏原提取物在过敏性疾病诊断与治疗中存在的问题，因此迫切需要发展新一代的诊疗方法与技术。分子克隆与基因工程技术的出现，使得研究人员可以更加准确的鉴定、研究过敏原蛋白，并且促进重组过敏原蛋白应用在过敏性疾病诊断和治疗方面。这些重组过敏原蛋白大部分已经被证明在生化、生物、结构和免疫学方面具有和天然过敏原同等的效力。与传统的过敏原提取物相比，经过人工改造的重组过敏原具有无可比拟的优势，可以克服上述提取物的种种缺陷，并且生产成本更低。尘螨过敏原是最重要的吸入性过敏原来源之一，普遍存在于室内，户尘螨和粉尘螨是最主要的两种螨，同属于尘螨属，它们是一种普通存在的生物，肉眼一般看不见。国际上一致认为在不同的地理位置和生活环境，优势螨种分布也有不同，但是在全世界范围内，居室内最优势的螨是粉尘螨和屋尘螨。研究表明，在所有过敏患者中约有一半的人对尘螨过敏，因此国内外多家知名公司开发并上市了以尘螨提取物为主要组分的脱敏治疗产品。屋尘螨过敏原是引发过敏性反应最常见的过敏原之一。在已经被分离到的23种屋尘螨过敏原当中，组群1（group1）和组群2（group2）是极具临床意义与价值的。屋尘螨过敏原组群2（Derp2）作为非常重要的屋尘螨过敏原，能被超过90%的屋尘螨过敏病人的血清特异性IgE(sIgE)识别。Derp2的分子量约为14kDa，含有3个二硫键，是一种非糖基化蛋白。它与其他屋尘螨过敏原产生于屋尘螨的消化道内，其以尘埃颗粒的形式飞扬于空气中，过敏体质者吸入后引发Ⅰ型超敏反应，从而引发特应性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、荨麻疹等过敏性疾病。目前临床上针对此类过敏性疾病的唯一对因治疗是采用尘螨过敏原疫苗进行脱敏治疗，也称过敏原特异性免疫治疗（SIT）。SIT是基于连续、反复、梯度地给予过敏患者引发过敏反应的特定过敏原，以达到改变患者对过敏原的免疫应答、对较高剂量过敏原产生免疫耐受的目的。通过基因工程技术，获得纯度高、性质单一的过敏原以应用于临床诊断及免疫治疗，是当今过敏性疾病诊疗的发展趋势。自从Derp2cDNA被分离和鉴定出来之后，表达重组Derp2以应用于诊断和免疫治疗就成为可能。但是，在此之前，以细菌原核表达的Derp2都以包涵体的形式存在，因此阻碍了重组Derp2在实际中的应用。大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统，具有遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强，生产成本低等显著优点。在基因表达技术中占有重要的地位，是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。异源蛋白质在大肠杆菌中表达产生不溶性的包涵体经常发生，其产生原因也异常复杂。以包涵体形式产生的蛋白质因为丧失正确的空间折叠而缺乏生物活性。从包涵体中获得有生物活性的蛋白必须经过繁琐复杂的蛋白质复性过程处理，一般说来，蛋白质的复性效率极低，因此在工业中，重组蛋白的生产应该尽量避免以包涵体的形式表达。分子伴侣蛋白广泛存在于细菌、酵母、哺乳动物中，能够参与到多种细胞生理过程中，例如帮助蛋白质进行折叠；参与蛋白复合体的组装；参与蛋白质转运、分泌等过程。不同分子伴侣之间的相互协调共同作用，可以保证细胞内的蛋白质处于稳定平衡的状态。触发因子(TriggerFactor，TF)是原核分子伴侣网络中的重要成员。TF具有分子伴侣活性的同时又有折叠酶活性，还能够调节蛋白折叠速度，协助蛋白质翻译之后的组装。诸多的研究表明，在TF的作用下，绝大部分蛋白质能够快速高效地完成正确的折叠，这使得TF在协助新生肽链折叠方面具有重要的作用和应用价值。
技术实现思路
本专利技术针对目前尘螨主要过敏原Derp2在大肠杆菌中以包涵体表达的技术不足，提供一种以TF作为标签融合可溶性表达Derp2以及其纯化制备的方法。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现：合成Derp2成熟体基因序列（GenBank登录号FM177223.1，如SEQIDNO:1所示），克隆到pCold-TFM大肠杆菌表达载体（在Derp2氨基端融合TF标签）。将重组质粒pC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在大肠杆菌中高可溶性表达并纯化屋尘螨主要过敏原Derp2蛋白的方法，包括以下步骤：合成Derp2成熟体基因序列（GenBank登录号FM177223.1），克隆到pCold‑TFM大肠杆菌表达载体（在Derp2 氨基端融合TF标签）；将重组质粒pCold‑TFM‑Derp2转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，挑选单克隆菌落，16℃ IPTG诱导胞内表达,融合蛋白呈可溶性；收集菌体经超声破碎后采用Ni‑琼脂糖凝胶亲和层析，HRV‑3C蛋白酶消化，凝胶过滤层析和离子交换层析的方法进行纯化，最终得到与天然产物相近的高纯度Derp2蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种在大肠杆菌中高可溶性表达并纯化屋尘螨主要过敏原Derp2蛋白的方法，包括以下步骤：合成Derp2成熟体基因序列（GenBank登录号FM177223.1），克隆到pCold-TFM大肠杆菌表达载体（在Derp2氨基端融合TF标签）；将重组质粒pCold-TFM-D...
【专利技术属性】
技术研发人员：魏准，于波，曹拓，杨旸，窦侠，张伟，
申请(专利权)人：深圳北京大学香港科技大学医学中心，
类型：发明
国别省市：广东;44
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