一种基于类弹性蛋白标签制备重组N-端脑钠肽前体的方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，涉及一种利用类弹性蛋白标签通过非色谱方法制备重组N‑端脑钠肽前体的方法。该方法通过基因重组，将N‑端脑钠肽前体基因克隆到pET28a(+)/ELP[I]40原核表达载体上，将重组表达载体转入到大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，收集菌体后，利用多次可逆相变循环ITC方法纯化重组蛋白，该蛋白即为ELP[I]40‑NT‑proBNP重组蛋白。本方法可快速、简便、高效纯化具有与抗NT‑proBNP抗体结合活性的融合蛋白，融合表达蛋白回收纯度可达到90％以上，为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。

A method of elastic protein tag based on the preparation of recombinant N terminal brain natriuretic peptide

The invention belongs to the field of biotechnology and relates to a method for using the elastic protein tag through non chromatographic methods for preparing recombinant N terminal brain natriuretic peptide. By means of the method of gene recombination, N terminal pro brain natriuretic peptide gene was cloned into pET28a (+) prokaryotic expression vector /ELP[I]40, the recombinant expression vector into E. coli BL21 (DE3) expression, cells were collected, using multiple reversible phase circulating ITC purification method of recombinant protein, the protein is ELP[I]40 NT proBNP recombinant protein. The method is rapid, simple and efficient purification of active fusion protein with anti NT antibody proBNP fusion protein, the recycling purity can reach more than 90%, to lay the foundation for the standard of high efficiency and low cost preparation with brain natriuretic peptide antigen.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种利用类弹性蛋白标签通过非色谱方法制备重组N-端脑钠肽前体的方法。
技术介绍
B-型脑钠肽(B-type natriuretic peptide，BNP)首先由日本学者在1988年从猪脑分离出来因而得名，后来研究发现其主要是由心肌细胞合成分泌。人类BNP基因编码134个氨基酸残基组成的pro-BNP前体，脱去26个氨基酸组成的信号肽后形成末端脑钠肽(pro-BNP)，再由蛋白水解酶裂解成为含有76个氨基酸无活性的N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)及含有32个氨基酸具有生理活性的BNP。心肌受到牵拉时pro-BNP被释放，并进一步分解为NT-proBNP和BNP。目前，NT-proBNP被广泛地应用于心血管疾病的诊断治疗及预后应用中。NT-proBNP作为检测抗原标准品的来源包括化学合成、大肠杆菌重组、真核细胞重组和心衰患者血浆分离等。由于其它几种来源成本较高，或者稳定性较差，目前主要来源为大肠杆菌重组获得。大肠杆菌一直是基因工程中发展最完善、应用最广泛的表达系统，它的优点有产量高，生产成本低，周期短，安全性好，可以高效表达不同外源基因产物等。然而利用大肠杆菌表达系统生产的NT-proBNP需要细胞裂解、亲和层析等分离纯化步骤，导致耗时大、成本高。类弹性蛋白(elastin-like polypeptide，ELP)是一种独特的重组蛋白分离纯化标签，主要结构由五肽重复序列单元(VPGXG)n串联组成，其中客座残基X可以是除脯氨酸以外的任一氨基酸，n代表ELP链中五肽重复次数。ELP具有温度诱导的可逆相变性质，当溶液温度低于相变温度(inverse temperature transition，Tt)时，ELP以单体形式溶于水溶液中；若温度高于Tt，ELP呈聚集态并从水溶液中析出；但当温度恢复到Tt以下时，ELP又会重新溶解，并且溶液温度只改变2-3℃即可发生两相之间的转变。ELP与目的蛋白融合后，赋予重组蛋白类似的可逆相变性质，多次可逆相变循环(inverse transition cycling，ITC)之后，就可以从蛋白混合液中选择性地分离出ELP融合蛋白。目前使用的ELISA检测试剂盒都需要特定的抗原作为标准品，其中的蛋白质类抗原占有很大的比例。如何低成本、高效生产蛋白质类抗原蛋白，是该类产品的一个技术关键。
技术实现思路
本专利技术目的是利用ELP可逆相变性质，提供一种基于类弹性蛋白标签制备重组N-端脑钠肽前体的方法，降低生产成本，实现简单、快速和大规模分离制备重组N-端脑钠肽前体。本专利技术的技术方案为：将N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)基因克隆到pET28a(+)/ELP[I]40原核表达载体上，利用大肠杆菌表达系统高效表达具有和脑钠肽前体的抗原活性相当的融合蛋白。具体步骤如下：1.构建NT-proBNP融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40/NT-proBNP：基于人源BNP基因序列(EMBL登入号码AB037521.1)，设计优化合成N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)基因，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，其长度为228个核苷酸；基于类弹性蛋白标签的制备重组N-端脑钠肽前体方法，包括以下步骤：(1)在N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)基因两端引入酶切位点EcoRⅠ/XhoⅠ；(2)将N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)基因克隆到pET28a(+)/ELP[I]40原核表达载体上，构建成融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40-NT-proBNP。所述的融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40-NT-proBNP的核苷酸序列为Seq ID.NO.2，其长度为6217个核苷酸。2.利用大肠杆菌表达重组蛋白：将构建的融合表达载体转化到大肠杆菌工程菌株，筛选得到阳性克隆，将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素，具体步骤为：将构建好的表达载体pET28a(+)/ELP[I]40-NT-proBNP电击转化到大肠杆菌菌株，将鉴定过的转化子接种到10毫升含有硫酸卡那霉素(Kanamycin Sulfate，Kan)的LB培养基中，过夜培养；次日，以1:100接种到500毫升含有Kan的LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37℃振荡培养，直至OD600达到0.6；在25℃-30℃、200rpm条件下添加1毫摩尔的IPTG(Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside)进行诱导表达3-6小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白；其中，LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L；硫酸卡那霉素的浓度为50微克每毫升，即每毫升LB培养基中含有50微克硫酸卡那霉素。3.收集菌体：表达重组蛋白后，加入PBS重悬，置冰浴中超声破碎，超声破碎条件为：80W，破碎时间2s，破碎间隔3s，总时间25min，超声破碎后，离心去除不溶物质，将上清移入新管。上清中加入DNase(DNA酶)，DNase在溶液中的最终浓度为50μg/mL，冰浴20min，离心力12000g离心15min，弃沉淀，将上清移入新管。利用ITC方法纯化重组蛋白，ITC纯化步骤为：(1)向上清液中添加NaCl，浓度最终达到为2mol/L，37℃水浴、20分钟，离心力12000g离心15min，弃上清；(2)加入20mL预冷的PBS重悬沉淀，冰浴20分钟，离心力10000g于4℃离心15分钟，弃沉淀，将上清移入新管，此即为一轮ITC循环。所得上清继续进行ITC纯化，经过3轮ITC纯化重组蛋白，该蛋白即为ELP[I]40-NT-proBNP重组蛋白。4、检测ELP[I]40/NT-proBNP重组蛋白的性质：根据蛋白UV定量法测定ELP[I]40/NT-proBNP重组蛋白的浓度；将重组蛋白ELP[I]40/NT-proBNP通过ELISA方法测定免疫血清的效价以及其在人血浆中免疫反应稳定性。本专利技术的有益效果：本方法可以高效、快速、简单的制备具有与抗NT-proBNP抗体结合活性的融合蛋白，融合表达蛋白回收纯度可达到90％以上，为高效低成本制备具有NT-proBNP抗原性的标准品奠定基础。本专利技术不仅适用于N-端脑钠肽前体的制备，也适用于其它重组蛋白质的快速大量制备。因此，本专利技术在大规模制备NT-proBNP重组蛋白和其它重组多肽的生产中具有较高实用价值。附图说明图1是本专利技术的NT-proBNP基因结构图。图2是本专利技术的融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40-NT-proBNP结构图谱。图3是为经过3轮ITC纯化后的重组蛋白ELP[I]40-NT-proBNP的SDS-PAGE电泳图，其中：1、2、3分别表示实施例一、二、三分离纯化的NT-proBNP重组蛋白，M表示标准蛋白质。图4为实施例一、二、三中的重组蛋白ELP[I]40-NT-proBNP的相变温度。图5为ELISA法检测实施例一、二、三中所产出的重组蛋白ELP[I]40-NT-proBNP的免疫活性图。图本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于类弹性蛋白标签制备重组N‑端脑钠肽前体的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)、构建NT‑proBNP融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40/NT‑proBNP：基于人源BNP基因序列，EMBL登入号码AB037521.1，设计优化合成N‑端脑钠肽前体(NT‑proBNP)基因，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，其长度为228个核苷酸；基于类弹性蛋白标签的制备重组N‑端脑钠肽前体方法，包括以下步骤：(1)在N‑端脑钠肽前体基因两端引入酶切位点EcoRⅠ/XhoⅠ；(2)将N‑端脑钠肽前体基因克隆到pET28a(+)/ELP[I]40原核表达载体上，构建成融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40‑NT‑proBNP；所述的融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40‑NT‑proBNP的核苷酸序列为Seq ID.NO.2，其长度为6217个核苷酸；2)、利用大肠杆菌表达重组蛋白：将构建的融合表达载体转化到大肠杆菌工程菌株，筛选得到阳性克隆，将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素，具体步骤为：将构建好的表达载体pET28a(+)/ELP[I]40‑NT‑proBNP电击转化到大肠杆菌菌株，将鉴定过的转化子接种到10毫升含有硫酸卡那霉素的LB培养基中，过夜培养；次日，以1:100接种到500毫升含有Kan的LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37℃振荡培养，直至OD600达到0.6；在25℃‑30℃、200rpm条件下添加1毫摩尔的IPTG(Isopropylβ‑D‑1‑Thiogalactopyranoside)进行诱导表达3‑6小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白；其中，LB培养基的配方如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L；硫酸卡那霉素的浓度为50微克每毫升，即每毫升LB培养基中含有50微克硫酸卡那霉素；3)、收集菌体：表达重组蛋白后，加入PBS重悬，置冰浴中超声破碎，超声破碎条件为：80W，破碎时间2s，破碎间隔3s，总时间25min，超声破碎后，离心去除不溶物质，将上清移入新管，上清中加入DNase(DNA酶)，DNase在溶液中的最终浓度为50μg/mL，冰浴20min，离心力12000g离心15min，弃沉淀，将上清移入新管，利用ITC方法纯化重组蛋白，ITC纯化步骤为：(1)向上清液中添加NaCl，浓度最终达到2mol/L，37℃水浴、20分钟，离心力12000g离心15min，弃上清；(2)加入20mL预冷的PBS重悬沉淀，冰浴20分钟，离心力10000g于4℃离心15分钟，弃沉淀，将上清移入新管，此即为一轮ITC循环；所得上清继续进行ITC纯化，经过3轮ITC纯化重组后，该蛋白即为ELP[I]40‑NT‑proBNP重组蛋白；4)、检测ELP[I]40/NT‑proBNP重组蛋白的性质。...

【技术特征摘要】
1.一种基于类弹性蛋白标签制备重组N-端脑钠肽前体的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)、构建NT-proBNP融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40/NT-proBNP：基于人源BNP基因序列，EMBL登入号码AB037521.1，设计优化合成N-端脑钠肽前体(NT-proBNP)基因，其核苷酸序列为Seq ID.NO.1，其长度为228个核苷酸；基于类弹性蛋白标签的制备重组N-端脑钠肽前体方法，包括以下步骤：(1)在N-端脑钠肽前体基因两端引入酶切位点EcoRⅠ/XhoⅠ；(2)将N-端脑钠肽前体基因克隆到pET28a(+)/ELP[I]40原核表达载体上，构建成融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40-NT-proBNP；所述的融合表达载体pET28a(+)/ELP[I]40-NT-proBNP的核苷酸序列为Seq ID.NO.2，其长度为6217个核苷酸；2)、利用大肠杆菌表达重组蛋白：将构建的融合表达载体转化到大肠杆菌工程菌株，筛选得到阳性克隆，将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素，具体步骤为：将构建好的表达载体pET28a(+)/ELP[I]40-NT-proBNP电击转化到大肠杆菌菌株，将鉴定过的转化子接种到10毫升含有硫酸卡那霉素的LB培养基中，过夜培养；次日，以1:100接种到500毫升含有Kan的LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37℃振荡培养，直至...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡学军，杨春光，丁宁，孙慎侠，韩立赤，于天舒，卫莹，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21