一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法。该方法由如下步骤组成：1)植物根际促生细菌的活化或筛选；2)菌株的驯化；3)菌株对有机磷农药的降解活性；4)环境因子对菌株降解有机磷农药能力的影响以及条件的优化；5)通过盆钵试验，研究菌株对土壤中有机磷农药的降解效果，从而分析菌株对有机磷农药污染土壤的生物修复潜能。本方法得到的菌株将能够长期保持防病促生功能和降解有机磷农药能力的稳定性；而且由于其功能的多样性，施入土壤后易于生存繁殖，从而更好的发挥其功能；另外，本发明专利技术方法操作简单，减少成本，省时省力。因此，本发明专利技术方法在多功能菌株的筛选及有机磷农药污染土壤的微生物修复等领域将会有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

:本专利技术涉及，主要用于已获得的植物根际促生细菌的驯化，通过驯化获得具有植物防病促生能力的多功能有机磷农药降解细菌。
技术介绍
:农药在农业生产中发挥了巨大的作用，据联合国粮农组织统计，如果不使用农药，全世界每年因病虫草害造成的损失约占农作物总产量的36%，年损失高达1250亿美元(Cooper and Dobson, 2007 ；Eddleston and Bateman, 2007)。农药的使用保证了农业的稳产丰收和人类的食物供应。有机磷农药(Organophosphorus pesticide, OPs)是当今农药的主要类别，具有经济、高效、方便等特点，是国内外广泛生产和使用的农药产品。但农药的大量使用对生态环境造成了很大的破坏性。农药利用率仅为10% 20 %，其余80 % 90 %最终将进入土壤环境，致使土壤中的农药残留严重，残留的农药随着食物链上升，最终危害人类健康(Carvalho，2006 ;Costa et al.，2008)。在世界上许多国家和地区，尤其是发展中国家，由于有机磷农药的持续大量使用已经对区域生态系统造成了严重的污染，在肉、奶制品、谷物、蔬菜和水果等产品中都不同程度检测到能够抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经传导功能紊乱，诱发免疫系统疾病，致使人中毒死亡的有机磷农药的残留。据统计，每年全世界发生300万例有机磷农药中毒事件，造成20万人死亡。为此，自20世纪80年代末以来，世界上许多研究机构都致力于探索有机磷农药污染环境的生物修复技术，并于1991年3月在美国圣地亚哥召开了第一届“原位与就地生物修复”国际会议，这一会议的召开，标志着以生物修复为核心的环境生物技术进入了一个全新的发展时期。环境修复技 术中，生物修复技术被公认为是效果好、见效快、简便易行、安全、廉价和环境友好、无二次污染的方法，已成为环境科学的研究热点，具有广阔的应用前景。常说的土壤生物修复技术主要就是指微生物修复。利用微生物修复土壤农药污染的主要原理是微生物利用有机农药作为碳源、氮源与磷源，将复杂有毒的农药化合物分解成简单无毒的化合物，或者彻底分解为C02、H2O, NH3和Cl—，从而降低农药在土壤中的残留量及毒性(Mansour and Gad, 2010 ;康纪婦，2010)。获得降解有机磷农药的微生物的途径有很多，最常用的是从受到有机磷农药严重污染的土壤中分离筛选出能降解有机磷农药的菌种。定向培育法是近年来常用的一种方法，即在特定的土壤中人为的多次施用农药，驯化出能降解这种农药的微生物，再通过富集培养，从中分离筛选能高效降解这种农药的菌株(赵宇蕾，2009 ;康纪婷，2010)。这种单一功能菌的纯化筛选，只根据所需的功能要求从自然界中分离、纯化，得到目的单一的菌株。这种筛选方法有其不足之处，一是在土壤中人为施用农药，使得其他菌株不能生存，导致目标菌株失去了与自然条件下长期处于协同关系的其它菌共存的机会，虽然目标菌株的目标功能有所强化，但功能单一；二是单一菌的纯化使其对生长条件的适应范围越来越狭窄，对发酵条件要求高，发酵成本昂贵；三是单一功能菌孤立生长，容易受到其它菌的污染和抑制，重新施入土壤后，难以生长繁殖和发挥功能。已分离的有机磷农药污染土壤生物修复的微生物中，以细菌和真菌为主(Foxand Mendz, 2006 ;郭子武，2008 ;Al_Qurainy and Abdel-Megeed, 2009 ；Forlani et al.,2011),细菌主要包括:假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄单胞杆菌属(Xanthamonus)、固瘤细菌属(Azotomonus)、硫杆菌属(Thiobacillus)等,其中假单胞菌属的菌株最活跃,对多种有机磷农药具有降解作用。真菌主要包括:曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Pinicielium)、木霉属(Trichoderma)、酵母菌(Saccharomyces)等。细菌由于其生理生化的多种适应能力以及容易诱发突变菌株，在降解有机磷农药的微生物中占有重要地位，因此对细菌的研究比较全面和深入。植物根围存在着大量微生物，自由生活在土壤或附生于植物根的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用 ，并能抑制有害微生物的有益菌类统称为植物根际促生菌(Plant Growth-Promoting Rhizobacteria,简称 PGPR)。PGPR 的作用机制为通过定殖于植物根系，优先占领根际，诱导植物产生IAA等生长激素，加速土壤磷、铁等养素循环，促进植物生长发育；提高植物对病原菌和环境胁迫的抗性和忍耐力；通过抑制拮抗根际的病原菌来保护植物，往往产生抗生素、铁载体、HCN、水杨酸，诱导ISR等抗性因子，帮助植物抵抗多种病原菌的侵害(Compant et al., 2010 ;康贻军等,2010)。由于PGPR具有改良土壤、改善作物品质、减少化肥和农药施用量、降低植物病害、提高作物产量等作用，因此，其自身及与菌根真菌的协同作用在农林牧业、食品安全、环境保护等方面具有重大应用潜势和价值。作为一类重要的植物根际促生菌，嗜铁细菌在促进植物生长和防治植物病害方面都发挥了很大的作用。研究证实嗜铁菌产生的嗜铁素可与植物根际病原微生物争夺有限的铁营养，从而抑制病原微生物生长繁殖，起到生物防治作用；同时植物可以利用微生物产生的嗜铁素螯合的铁，从而改善植物的铁营养，防治土壤植物缺铁失绿症的发生，促进植物生长(Miethke and Marahiel，2007 ;余贤美，2009)。国内外学者对嗜铁菌的筛选，嗜铁菌的防病促生效果及其机理，以及嗜铁素合成相关基因等方面进行了广泛的研究。在土壤污染生物修复过程中，土壤、植物与微生物间相互作用，微生物可通过促进植物生长、为植物提供营养物质或产生抗性代谢产物控制植物病害等方式，加快土壤污染植物修复的效率，增强修复效果。但是，迄今为止，植物根际促生菌(杨蓉等，2012;郭长虹等，2012)和用于有机磷农药污染土壤生物修复的微生物(彭霞薇等，2011 ;姜健等2012)是分开筛选研究的，即使发现某菌株具有营养、抑病及降解有机磷农药的功能(吴皓琼等，2012)，但并没有涉及同时具有这几种功能的菌株的具体筛选方法。主要参考文献:郭子武.笋用竹林地有机农药污染土壤微生物修复机理研究.中国林业科学研究院博士学位论文，2008.姜健，杨宝灵，范方，王冰，温小红，刘淼.2012.利用紫花苜蓿-有机磷农药降解菌联合修复有机磷农药污染土壤的方法.专利技术专利申请号:CN102755991A。康纪婷.有机磷农药草甘膦降解菌的筛选、分离及其鉴定.四川农业大学硕士学位论文，2010.康贻军，程洁，梅丽娟，等.植物根际促生菌作用机制研究进展.应用生态学报，2010，21 (I):232-238.彭霞薇，姜丹，荆梦，安晓宇，杨建州，白志辉.2011.—株降解有机磷农药的芽孢杆菌及其菌剂的生产方法.专利技术专利号:CN101705201B.吴皓琼，牛彦波，曹亚彬，郭立姝，殷博.2012.—种具有营养、抑病及降解有机磷农药的枯草芽孢杆菌.专利技术专本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于：在已有筛选自土壤的植物根际促生细菌菌株的基础上，通过改良的定向培育法，即在培养基中添加农药，对已有菌株进行驯化筛选，获得同时具有植物防病促生能力的多功能有机磷农药降解细菌菌株。

【技术特征摘要】
1.一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于:在已有筛选自土壤的植物根际促生细菌菌株的基础上，通过改良的定向培育法，即在培养基中添加农药，对已有菌株进行驯化筛选，获得同时具有植物防病促生能力的多功能有机磷农药降解细菌菌株。2.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在于:在常用细菌培养基(如LB培养基)中添加有机磷农药，农药浓度为50mg/L，100mg/L,200mg/L，400mg/L, 800mg/L, 2000mg/L,以及更高的浓度。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:在驯化过程中，将能够在含有较低浓度有机磷农药的培养基中生存繁殖的菌株接种于含有更高浓度有机磷农药的培养基中，逐步提高培养基中有机磷农药的浓度，以期获得菌株对更高浓度有机磷农药的耐受性。4.根据权利要求1和2所述的方法，其特征在于:由于不同菌株对不同有机磷农药的耐受性不同，用于菌株驯化的初始农药浓度、农药浓度增加的幅度和梯度，以及菌株对不同有机磷农药的最高耐受浓度会有所不同。5.根据权利要求1所述的一种多功能有机磷农药降解细菌的筛选方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：余贤美，艾呈祥，于婷，董庆龙，安淼，王海荣，刘嘉芬，
申请(专利权)人：山东省果树研究所，
类型：发明
国别省市：