本发明专利技术涉及一种检测湖泊藻类有机磷的降解方法及应用,属于水资源生态环境治理领域。本发明专利技术利用液态31P‑NMR技术与酶水解相结合的方法检测湖泊藻类有机磷，通过添加不同有机磷水解酶，模拟藻类死亡腐烂分解后有机磷在湖泊水体以及沉积物中的降解特性及释放规律，并估算藻类有机磷对湖泊内源磷的贡献量，以期为探索富营养化湖泊内源磷的生物地球化学循环机理提供重要科学依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测湖泊藻类有机磷的降解方法及应用,属于水资源生态环境治理领域。
技术介绍
全球水资源短缺的重要原因之一就是水体污染，而湖泊富营养化是水体污染的普遍现象，蓝藻水华频繁暴发是湖泊富营养化的重要生态响应。磷、氮等营养元素的增加是导致蓝藻暴发的重要原因。这些营养元素过量积累在湖泊中，将会引起浮游藻类的迅速繁殖，从而形成蓝藻水华暴发现象。磷作为湖泊生态系统富营养化的限制性主要因素之一，成为目前富营养化研究的重点元素。湖泊中的磷主要分为外源性磷及内源性磷，在外源磷输入得到控制的前提下，内源磷作为限制性营养盐显著影响湖泊生态系统的营养状态。内源磷的释放是导致湖泊生态系统富营养状态继续恶化的主导因素，而藻类腐烂分解是内源营养盐的重要来源，它们影响湖泊生态系统中的各种生物地球化学过程，主要包括营养循环、食物链过程、温度、光照、大气以及各种水文过程中的动态变化，沉积物的形成以及水体和沉积物界面的氧化还原状态等，因此，研究藻类来源磷的地球化学循环显得尤为重要。湖泊水体中的磷主要有两种形态，分别是无机磷和有机磷。其中无机磷极易被水生生物吸收利用，而有机磷由于自身结构复杂且受到表征手段的限制，以往研究多集中于湖泊生态系统中的无机磷分析与探索，对有机磷的研究相对较为匮乏，仅有的研究也只针对有机磷的量(即总磷与无机磷差减后的量)进行简单分析。当外源输入得到一定控制的条件下，蓝藻暴发过程中为维持自身的生长繁殖将消耗掉湖泊水体中大量的无机磷，但一般蓝藻暴发持续时间产达数个月，除了沉积物的释放以外，大量的藻类残骸腐烂降解产生的有机物(包括有机磷、有机氮、有机碳等)是否会对蓝藻持续暴发提供可以吸收利用的营养物质呢？其中的有机磷是否能够快速补充蓝藻二次暴发所需要的磷源呢？当湖泊水体中无机磷含量降低时，磷的另外一个重要形态——有机磷将会有哪些降解或转化呢？这是一个值得深思的问题。但目前现阶段对于富营养化湖泊中蓝藻暴发产生的优势藻类可利用性的分析研究十分匮乏。富营养化湖泊中广泛存在着酶等微生物，在这些微生物的作用下，占藻类总磷一半含量的有机磷是否会在微生物的作用下发生转化？如果发生转化，在哪种酶(碱性磷酸酶、磷酸二酯酶、植酸酶等)的作用下转化率最大？转化后的磷可能进入湖泊水体中，这些磷是否会增加湖泊水体中的磷浓度或改变湖泊自然环境？转化的磷是否会有部分容易被生物再次利用？如果可以利用，又对水华再次暴发起到什么作用？除了藻类残体释放出的磷以外，还有部分不能完全被微生物所分解，那么其余残渣磷组分的化学结构又是怎样的？伴随着这些未知，因此，在实验室中控制好外部环境条件(如pH、温度等)，添加酶溶液和缓冲溶液同步进行模拟实验，分析湖泊藻类残体腐烂分解后的降解特征及释放规律，这对内源磷的循环机理探索以及政府对富营养化湖泊的管理与治理具有重要决策意义。
技术实现思路
本专利技术为了解决上述技术问题提供一种检测湖泊藻类有机磷的降解方法及应用，本申请以富营养化湖泊限制性营养因子——磷这种营养盐为切入点，对富营养化湖泊中具有典型代表意义的藻类(微囊藻、小球藻、螺旋藻)进行湖泊内源负荷的相关研究，深入探讨藻类对湖泊磷循环过程所起的重要贡献，以期为深入理解内源污染对富营养化湖泊生态系统物质循环和环境行为特性提供科学依据。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测湖泊藻类有机磷的降解方法,包括：1)有机磷水解酶的组合设计本专利技术选择富营养化湖泊中广泛存在的三种酶碱性磷酸酶(简称APase)、磷酸二酯酶(简称PDEase)和植酸酶(简称Phytase)作为降解藻类有机磷的水解酶，由于碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶分别水解不同结构的有机磷，使其转化为生物可直接利用的正磷酸盐，故将三种酶单独或组合使用，以达到表征藻类中的有机磷形态、降解特征及其生物可利用性的目的，具体为：①碱性磷酸酶单独使用，水解活性单酯磷及聚合态磷；②碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合使用，水解活性单酯磷、二酯磷及聚合态磷；③碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合使用，水解活性单酯磷、二酯磷、植酸磷及聚合态磷；其中，②与①相减，得二酯磷的含量，③与②相减，得植酸磷的含量；2)有机磷水解酶溶液的配置所述碱性磷酸酶(编号为EC3.1.3.1)来源于牛肠粘膜，固体粉末的活性为30U/mg；所述磷酸二酯酶(编号EC3.1.4.1)来源于响尾蛇毒液，固体粉末的活性为0.02U/mg；所述植酸酶(编号EC3.1.3.26)来源于小麦，固体粉末的活性为0.03U/mg，上述三种酶均购自美国Sigma公司；2.1)碱性磷酸酶溶液的配置方法：取3.33mg碱性磷酸酶固体粉末，用0.1mol/LpH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液定容至100mL,配置成活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液；2.2)碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液的配置方法：取10mg磷酸二酯酶固体粉末，用10mL活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液溶解，配置成活性为0.02U/mL的碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液；2.3)碱性磷酸酶、磷酸二酯酶与植酸酶组合溶液的配置方法：A)取600mg植酸酶固体粉末，用1mol/LHAc-NaAc溶液定容至100mL，得活性为0.18U/mL的第一植酸酶溶液；B)取5mL0.18U/mL的第一植酸酶溶液，加入5mL0.1mol/LpH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，得活性为0.045U/mL的第二植酸酶溶液；C)取20mg磷酸二酯酶固体粉末，加入10mL0.045U/mL的第二植酸酶溶液，再加入10mL1U/mL的碱性磷酸酶溶液，配置成活性为0.06U/mL的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液；上述步骤2.1)-2.3)配置的三种酶溶液均置于4℃冷藏，且冷藏不得超过一星期，否则弃去重配；3)酶水解实验3.1)碱性磷酸酶水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液和1mL1mol/L的迭代化纳(NaN3)溶液，向处理组中添加190mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液、1mL1mol/L的NaN3溶液和10mL1U/mL的碱性磷酸酶溶液，两组实验均放置在20℃恒温培养箱中150r/min振荡培养18h，实验设置三个平行；3.2)碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合使用的水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液和1mL1mol/L的NaN3溶液，向处理组中添加190mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液、1mL1mol/L的NaN3溶液和10mL0.02U/mL的碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液，两组实验均放置在20℃恒温培养箱中150r/min振荡培养18h，实验设置三个平行；3.3)碱性磷酸酶、磷酸二酯酶与植酸酶组合使用的水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL0.1mol/LpH＝5.15本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测湖泊藻类有机磷的降解方法,其特征在于，包括：1)有机磷水解酶的组合设计①碱性磷酸酶单独使用，水解活性单酯磷及聚合态磷；②碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合使用，水解活性单酯磷、二酯磷及聚合态磷；③碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合使用，水解活性单酯磷、二酯磷、植酸磷及聚合态磷；其中，②与①相减，得二酯磷的含量，③与②相减，得植酸磷的含量；2)有机磷水解酶溶液的配置所述碱性磷酸酶来源于牛肠粘膜，固体粉末的活性为30U/mg；所述磷酸二酯酶来源于响尾蛇毒液，固体粉末的活性为0.02U/mg；所述植酸酶来源于小麦，固体粉末的活性为0.03U/mg，上述三种酶均购自美国Sigma公司；2.1)碱性磷酸酶溶液的配置方法：取3.33mg碱性磷酸酶固体粉末，用0.1mol/L pH＝9.0的Tris‑HCl缓冲溶液定容至100mL,配置成活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液；2.2)碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液的配置方法：取10mg磷酸二酯酶固体粉末，用10mL活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液溶解，配置成活性为0.02U/mL的碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液；2.3)碱性磷酸酶、磷酸二酯酶与植酸酶组合溶液的配置方法：A)取600mg植酸酶固体粉末，用1mol/L HAc‑NaAc溶液定容至100mL，得活性为0.18U/mL的第一植酸酶溶液；B)取5mL 0.18U/mL的第一植酸酶溶液，加入5mL 0.1mol/L pH＝7.0的Tris‑HCl缓冲溶液，得活性为0.045U/mL的第二植酸酶溶液；C)取20mg磷酸二酯酶固体粉末，加入10mL 0.045U/mL的第二植酸酶溶液，再加入10mL 1U/mL的碱性磷酸酶溶液，配置成活性为0.06U/mL的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液；上述步骤2.1)‑2.3)配置的三种酶溶液均置于4℃冷藏，且冷藏不得超过一星期，否则弃去重配；3)酶水解实验3.1)碱性磷酸酶水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL 0.1mol/L pH＝9的Tris‑HCl缓冲溶液和1mL 1mol/L的迭代化纳溶液，向处理组中添加190mL 0.1mol/L pH＝9的Tris‑HCl缓冲溶液、1mL 1mol/L的NaN3溶液和10mL 1U/mL的碱性磷酸酶溶液，两组实验均放置在20℃恒温培养箱中150r/min振荡培养18h，实验设置三个平行；3.2)碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合使用的水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL 0.1mol/L pH＝9的Tris‑HCl缓冲溶液和1mL 1mol/L的NaN3溶液，向处理组中添加190mL 0.1mol/L pH＝9的Tris‑HCl缓冲溶液、1mL 1mol/L的NaN3溶液和10mL 0.02U/mL的碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液，两组实验均放置在20℃恒温培养箱中150r/min振荡培养18h，实验设置三个平行；3.3)碱性磷酸酶、磷酸二酯酶与植酸酶组合使用的水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL 0.1mol/L pH＝5.15的HAc‑NaAc缓冲溶液和1mL 1mol/L的NaN3溶液，向处理组中添加190mL 0.1mol/L pH＝5.15的HAc‑NaAc缓冲溶液，1mL 1mol/L的NaN3溶液，和10mL 0.06U/mL的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶与植酸酶组合溶液，两组实验均放置在20℃恒温培养箱中150r/min振荡培养18h，实验设置三个平行；分别取上述三个实验中对照组和处理组培养后的上清液各10mL，10000r/min离心30min，过0.45μm滤膜，利用磷钼蓝比色法分别测定处理组酶培养后上清液中的总磷含量TP处理组和无机磷含量Pi处理组，对照组培养后上清液中的总磷含量TP对照组和无机磷含量Pi对照组，则加酶后上清液中有机磷Po水解量＝Pi处理组‑Pi对照组，测完上清液中的无机磷含量Pi后，其余的190mL上清液和残渣均冷冻干燥，为下一步测31P‑NMR做准备；4)测液态31P‑NMR向冷干的残渣中加入30mL NaOH与EDTA组成的混合溶液，其中，NaOH的浓度为0.5mo/L，EDTA的浓度为0.25mmol/L，振荡16h提取残渣中的有机磷，于10000r/min下离心30min后，0.45μm滤膜过滤，留取残渣中的滤后液冷干，得残渣滤后液；把冷干后的上清液和残渣滤后液分别溶解于1mL NaOH与EDTA组成的混合溶液中，其中，NaOH的浓度为1mo/L，EDTA的浓...
【技术特征摘要】
1.一种检测湖泊藻类有机磷的降解方法,其特征在于，包括：1)有机磷水解酶的组合设计①碱性磷酸酶单独使用，水解活性单酯磷及聚合态磷；②碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合使用，水解活性单酯磷、二酯磷及聚合态磷；③碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合使用，水解活性单酯磷、二酯磷、植酸磷及聚合态磷；其中，②与①相减，得二酯磷的含量，③与②相减，得植酸磷的含量；2)有机磷水解酶溶液的配置所述碱性磷酸酶来源于牛肠粘膜，固体粉末的活性为30U/mg；所述磷酸二酯酶来源于响尾蛇毒液，固体粉末的活性为0.02U/mg；所述植酸酶来源于小麦，固体粉末的活性为0.03U/mg，上述三种酶均购自美国Sigma公司；2.1)碱性磷酸酶溶液的配置方法：取3.33mg碱性磷酸酶固体粉末，用0.1mol/LpH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液定容至100mL,配置成活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液；2.2)碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液的配置方法：取10mg磷酸二酯酶固体粉末，用10mL活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液溶解，配置成活性为0.02U/mL的碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合溶液；2.3)碱性磷酸酶、磷酸二酯酶与植酸酶组合溶液的配置方法：A)取600mg植酸酶固体粉末，用1mol/LHAc-NaAc溶液定容至100mL，得活性为0.18U/mL的第一植酸酶溶液；B)取5mL0.18U/mL的第一植酸酶溶液，加入5mL0.1mol/LpH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，得活性为0.045U/mL的第二植酸酶溶液；C)取20mg磷酸二酯酶固体粉末，加入10mL0.045U/mL的第二植酸酶溶液，再加入10mL1U/mL的碱性磷酸酶溶液，配置成活性为0.06U/mL的碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液；上述步骤2.1)-2.3)配置的三种酶溶液均置于4℃冷藏，且冷藏不得超过一星期，否则弃去重配；3)酶水解实验3.1)碱性磷酸酶水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液和1mL1mol/L的迭代化纳溶液，向处理组中添加190mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液、1mL1mol/L的NaN3溶液和10mL1U/mL的碱性磷酸酶溶液，两组实验均放置在20℃恒温培养箱中150r/min振荡培养18h，实验设置三个平行；3.2)碱性磷酸酶与磷酸二酯酶组合使用的水解实验分别取藻类样品微囊藻、小球藻和螺旋藻各0.2g，置于500mL锥形瓶中，设置对照组和处理组，向对照组中添加200mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液和1mL1mol/L的NaN3溶液，向处理组中添加190mL0.1mol/LpH＝9的Tris-HCl缓冲溶液、1mL1mol/L的NaN3溶液和10mL0.02U/mL的碱性磷酸酶与磷...
【专利技术属性】
技术研发人员：冯伟莹，吴丰昌，朱元荣，白英臣，张琛，宋凡浩，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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