一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷农药的亲和磁性微球、及其制备和使用方法技术

本发明专利技术公开了一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷农药的亲和磁性微球、及其制备和使用方法，该亲和磁性微球在多孔或中空微球内部聚合有磁性离子，在多孔或中空微球的表面包覆有乙酰胆碱脂酶或抗氨基甲酸酯和有机磷类农药抗体；其制备方法包括乙酰胆碱酯酶在磁性微球表面固定及磁性微球的表面封闭。本发明专利技术能够有效的提取样本中的氨基甲酸酯和有机磷类农药，以解决现有技术中的复杂基质带来的假阳性/假阴性的结果，提高实际样本中农药现场残留检测的准确性和可靠性。

【技术实现步骤摘要】
一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷农药的亲和磁性微球、及其制备和使用方法
本专利技术涉及农药检测领域，具体涉及一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷农药的亲和磁性微球、及其制备和使用方法。
技术介绍
多年来，蔬菜中农药残留超标问题一直较突出，原因之一是现在标准施行的农药残留测定需要通过有机溶剂提取、净化和用大型分析仪器进行，无法对廉价的蔬菜进行随时随地的快速检测。目前应用于农残快速检测的方法主要有酶抑制法和酶联免疫吸附法。酶抑制法是利用有机磷与氨基甲酸酯类农药可特异性地抑制昆虫中枢和周围神经系统中乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性，破坏神经的正常传导，使昆虫中毒致死这一毒理学原理，将AChE与样品反应，根据AChE活性受到抑制的情况，可判断出样品中是否含有有机磷与氨基甲酸酯类农药。酶抑制法检测技术虽具有方便、快速、成本低等优点，但在使用过程中也存在一些亟待解决的问题：如酶源的选择，动物体内的酯酶十分复杂，如乙酰胆碱酯酶(AChE)、丁酰胆碱酯酶(BuChE)等，不同来源不同酯酶对农药的反应大不相同，因此敏感酶源的选择与提取是检测准确性的关键，同一批次样品必须选用同一批次酶源；酶促条件，酶是一种特异性的蛋白质，酶促反应要求十分严格，温度、酸碱度、氧化还原电位是左右酶促反应的重要条件；某些农产品种类不能检测或有影响，如芹菜、韭菜等样品含有过多的叶绿素、花青素、植物次生物质，对检测结果有干扰，造成检测结果呈假阳性等。目前对有机磷与氨基甲酸酯类农药的快速检测技术集中在基于酶抑制和纸片法，基于共同的检测原理即是采用乙酰胆碱酯酶(AChE)与农药的特异性结合，造成酶活力的降低或消失，通过间接测定酶活力来进行农药残留的检测。如中国专利ZL201310116604.8利用温敏微胶囊技术制成检测试纸，在特定温度临界区域，释放包裹的胆碱酯酶，催化靛酚乙酸酯水解显色，进而判定农药残留情况。本专利技术为一次性使用，价格低廉，不需要专门配制试剂，省去分析仪器的维护工作；使用较人工挤压更简单，结果判定一目了然，无须培训；试剂用量更少，检测时间更短，在1min内完成；胆碱酯酶受微胶囊保护更稳定，保存时间长。中国专利ZL201010523463.8次揭示了一种基于乙酰胆碱酯酶的显色方法，该方法采用了特殊的显色剂，使得阴阳性显色结果非常明显，且无需分光光度计，肉眼可直接判断。中国专利申请CN201510056439.0公开了一种有机磷和氨基甲酸酯类农药残留速测卡，包括下盖及与下盖相扣合的上盖，上盖设有加样孔及观察孔，下盖内固定有测试农药残留的速测纸，速测纸包括底板及在底板中部粘贴固定的爬样膜，爬样膜的一端依次粘贴显色垫及吸水垫，爬样膜的另一端依次粘贴隔膜及酶垫,观察孔的位置对应观察显色垫的位置，加样孔的位置对应酶垫的位置，检测时间短，操作简单，侧向层析使得抗干扰能力强，显色效果好，可广泛应用于有机磷以及氨基甲酸酯类农药的快速检测。上述相关专利，都未能解决实际样品基质对检测的影响，如芹菜、韭菜等样品含有过多的叶绿素、花青素、植物次生物质，对检测结果有干扰，造成检测结果呈假阳性等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷农药的亲和磁性微球、及其制备和使用方法，能够应用到现场检测中。以解决现有技术中农药现场检测存在较大的假阳性问题。本专利技术将乙酰胆碱酯酶与磁性微球共同反应一段时间后，制备出具有特异性的亲和磁性微球。将实际样品的粗提溶液与该磁性微球共同反应一段时间后，即可实现氨基甲酸酯和有机磷类农药吸附到磁性微球表面。经磁性分离后，即可实现将氨基甲酸酯和有机磷类农药样本净化，消除色素基质的影响，得到相对纯的待检样本，进一步用于荧光检测、免疫检测、酶抑制、酶比色等，以下具体阐述本专利技术的构思。首先，本专利技术提供一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷农药的亲和磁性微球的制备方法，具体技术方案如下：一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷农药的亲和磁性微球的制备方法，包括以下步骤：A、乙酰胆碱酯酶在磁性微球表面固定取磁性微粒悬液加入到离心管中，轻摇重悬；置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；加入偶联缓冲液，轻摇重悬；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清后备用；取乙酰胆碱酯酶配制得到备用溶液，取适量加入磁性微粒中，使磁性微粒和乙酰胆碱酯酶或抗氨基甲酸酯和有机磷类农药抗体反应浓度为0.1～10mg/ml使得其达到最大偶联率；反应完毕，磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液，轻摇重悬磁粒；磁性分离，弃上清，除去非特异性吸附在磁性微粒表面的酶，得到亲和磁性微球粗品；B、磁性微球的表面封闭在步骤A得到的亲和磁性微粒粗品中加入封闭剂，封闭磁性微粒粗品上未与酶结合的位点；用清洗缓冲液多次清洗，最后悬于保存缓冲液中，2～8℃保存，即制得亲和磁性微球。优选地，所述偶联缓冲液为0.05～0.5M、pH7.0～8.0的PBS缓冲液，或0.05～0.5M、pH7.0～7.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，或0.05～0.5M、pH4～6的MES缓冲溶液。清洗缓冲液是含0.05％吐温的偶联缓冲液；封闭剂是含5～10％脱脂奶1～10％牛血清白蛋白BSA，或1～5％小牛血清，或1～5％的聚乙二醇的偶联缓冲液；保存缓冲液是含0.1～1％BSA的0.05～0.5M、pH7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。其次，本专利技术还提供上述亲和磁性微球的使用方法，包括以下步骤：(1)、按照上述的制备方法制得亲和磁性微球；(2)、亲和磁性微球捕获氨基甲酸酯和有机磷类农药a.样本中氨基甲酸酯和有机磷类农药的提取取样本溶于甲醇-水、或者乙腈-水中，充分提取，提取液经过滤后以PBS稀释；b.取步骤(1)制得的亲和磁性微球，磁性分离，弃上清，再加入捕获缓冲液，满足最大限度捕获样品中的氨基甲酸酯和有机磷类农药；轻摇重悬，磁性分离，弃上清；加入稀释后的实际样本，在摇床中37℃，180r/min反应10～15min；亲和磁性微球捕获氨基甲酸酯和有机磷类农药后，再经磁性分离，从而实现氨基甲酸酯和有机磷类农药样本的净化；去除磁性分离后的上清，沉淀即为捕获了氨基甲酸酯和有机磷类农药的亲和磁性微球；本步骤中采用的捕获缓冲液为pH6.5～7.6的1×PBS缓冲液；(3)磁性微粒的洗脱向步骤(2)中得到的亲和磁性微球中加入洗脱液进行洗脱，室温震荡，磁性分离，上清即为净化后的氨基甲酸酯和有机磷类农药待检样本；(4)农药快速检测将步骤(3)中得到的待检样本，加入到荧光检测、酶抑制、纸片检测中，实现氨基甲酸酯和有机磷类农药的快速检测。优选地，步骤(2)b中，加入稀释后的氨基甲酸酯和有机磷类农药样本，在37℃中进行温育，反应10-15min；经洗脱提取后的样本能够直接用于后续的快速检测体系。优选地，步骤3)中所述洗脱液采用20％～40％乙腈，亲和磁性微球在洗脱液中的浓度为0.05～50mg/ml；室温振荡0.5～5min。最后，本专利技术的又一目的是提供一种磁性微球，具体技术方案如下：一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷类农药的亲和磁性微球，在多孔或中空微球内部聚合有磁性离子，在多孔或中空微球的表面包覆有乙酰胆碱脂酶或抗氨基甲酸酯和有机磷类农药抗体。优选地，该磁性微球粒径在20-10000nm，并具有超顺磁性。本专利技术能够本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷类农药的亲和磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、乙酰胆碱酯酶在磁性微球表面固定取磁性微粒悬液加入到离心管中，轻摇重悬；置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；加入偶联缓冲液，轻摇重悬；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清后备用；取乙酰胆碱酯酶配制得到备用溶液，取适量加入磁性微粒中，使磁性微粒和乙酰胆碱酯酶或抗氨基甲酸酯和有机磷类农药抗体反应浓度为0.1～10mg/ml使得其达到最大偶联率；反应完毕，磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液，轻摇重悬磁粒；磁性分离，弃上清，除去非特异性吸附在磁性微粒表面的酶，得到亲和磁性微球粗品；B、磁性微球的表面封闭在步骤A得到的亲和磁性微粒粗品中加入封闭剂，封闭磁性微粒粗品上未与酶结合的位点；用清洗缓冲液多次清洗，最后悬于保存缓冲液中，2～8℃保存，即制得亲和磁性微球。

【技术特征摘要】
1.一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷类农药的亲和磁性微球的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A、乙酰胆碱酯酶在磁性微球表面固定取磁性微粒悬液加入到离心管中，轻摇重悬；置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清；加入偶联缓冲液，轻摇重悬；将离心管置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清后备用；取乙酰胆碱酯酶配制得到备用溶液，取适量加入磁性微粒中，使磁性微粒和乙酰胆碱酯酶或抗氨基甲酸酯和有机磷类农药抗体反应浓度为0.1～10mg/ml使得其达到最大偶联率；反应完毕，磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液，轻摇重悬磁粒；磁性分离，弃上清，除去非特异性吸附在磁性微粒表面的酶，得到亲和磁性微球粗品；B、磁性微球的表面封闭在步骤A得到的亲和磁性微粒粗品中加入封闭剂，封闭磁性微粒粗品上未与酶结合的位点；用清洗缓冲液多次清洗，最后悬于保存缓冲液中，2～8℃保存，即制得亲和磁性微球。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述偶联缓冲液为0.05～0.5M、pH7.0～8.0的PBS缓冲液，或0.05～0.5M、pH7.0～7.6的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，或0.05～0.5M、pH4～6的MES缓冲溶液。清洗缓冲液是含0.05％吐温的偶联缓冲液；封闭剂是含5～10％脱脂奶1～10％牛血清白蛋白BSA，或1～5％小牛血清，或1～5％的聚乙二醇的的偶联缓冲液；保存缓冲液是含0.1～1％BSA的0.05～0.5M、pH7.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。3.一种用于净化和检测氨基甲酸酯和有机磷类农药的亲和磁性微球的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、按照权利要求1或2所述的制备方法制得亲和磁性微球；(2)、亲和磁性微球捕获氨基甲酸酯和有机磷类农药a.样本中氨基甲酸酯和有...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡云平，张路，齐延林，王舒乐，林梓填，
申请(专利权)人：深圳市瑞赛生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44