用于有机磷农药检测的乙酰胆碱酯酶生物传感器及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种乙酰胆碱酯酶生物传感器及其制备方法，该生物传感器用于快速测定有机磷农药，属于分析技术领域。本发明专利技术利用离子液体功能化石墨烯和明胶的优良特性，将离子液体功能化石墨烯（IL‑GR）用于乙酰胆碱酯酶（AChE）的固定，利用明胶（Gel）良好的生物相容性和成膜能力，制备了新型复合膜IL‑GR‑Gel修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器，并实现有机磷农药的高灵敏检测。该方法克服了现有有机磷测定方法速度慢，成本高，操作繁琐的缺点，提供了一种简单，快速，灵敏度高的有机磷农药测定方法。

Acetylcholinesterase biosensor for detecting organophosphorus pesticides and preparation method thereof

The invention discloses a acetylcholinesterase biosensor and a preparation method thereof. The biosensor is used for the rapid determination of organophosphorus pesticides, and belongs to the technical field of analysis. The invention utilizes the excellent properties of ionic liquid functionalized graphene and gelatin, ionic liquid functionalized graphene (IL GR) for acetylcholinesterase (AChE) immobilized by gelatin (Gel) with good biocompatibility and film-forming ability, a novel composite membrane acetylcholinesterase biosensor IL GR Gel modified. Preparation and implementation of high sensitive detection of organophosphorus pesticides. The method overcomes the disadvantages of slow speed, high cost and complicated operation of the existing organic phosphorus determination method, and provides a simple, fast and high sensitivity organophosphorus pesticide determination method.

【技术实现步骤摘要】
用于有机磷农药检测的乙酰胆碱酯酶生物传感器及其制备方法
本专利技术涉及一种乙酰胆碱酯酶生物传感器及其制备方法，该生物传感器用于快速测定有机磷农药，属于分析

技术介绍
随着现代农业的发展，越来越多的农药被用于农业生产，其中有机磷(OPs)农药是目前使用最为广泛的品种，其高毒性和高残留性直接危害了人民健康。因此，建立快速、灵敏的OPs检测方法显得非常必要。我国现行OPs农药国家标准主要检测方法为色谱法。色谱法定量准确,但仪器体积庞大,样品前处理过程繁琐，对检测人员的技术要求高，而且不适合现场快速检测。近年来基于乙酰胆碱酯酶(AChE)的电化学生物传感器已在有机磷农药残留检测方面得到了很好的应用，相对于传统的色谱法，电化学生物传感器具有简单、快速、实用、可靠、灵敏等优点。但是到目前为止，AChE生物传感器仍存在灵敏度低和稳定性差等方面的问题，研制高灵敏及稳定性好的AChE生物传感器仍值得探索。对于AChE生物传感器,固定AChE的数量直接影响传感器的灵敏度。因此,开发新型的AChE固定材料,增加AChE的负载量,是提高AChE传感器灵敏度的关键。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种负载量高、灵敏度高的新型乙酰胆碱酯酶生物传感器，实现有机磷农药的快速高效检测。另一目的在于提供其制备方法。为实现本专利技术目的，技术方案如下：该乙酰胆碱酯酶生物传感器通过以下方法制备而成：(1)氨基功能化离子液体1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL-NH2)的合成3-溴丙胺氢溴酸盐和N-甲基咪唑混合，以无水乙醇作为溶剂，氮气保护，回流反应，旋蒸除去溶剂，适量乙醚超声洗涤，调节pH值在8-9，旋蒸除去水制得1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑溴盐，然后和四氟硼酸钠发生离子交换制得1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐。3-溴丙胺氢溴酸盐和N-甲基咪唑摩尔比：1:1。(2)离子液体功能化石墨烯(IL-GR)的合成石墨粉缓缓地加入浓硫酸中，搅拌反应，冰水浴条件下，搅拌状态下慢慢加入KMnO4，控制温度在35-40℃，恒温反应。反应后将其加入蒸馏水中，搅拌下加入H2O2，反应结束后，洗涤产物，干燥，得到石墨烯氧化物(GO)。将GO、1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和KOH混合，80-90℃搅拌反应，尔后加入NaBH4溶液得到离子液体功能化石墨烯(IL-GR)。石墨粉、浓硫酸、KMnO4、H2O2摩尔比：4:18:1.2:4。GO、1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和KOH的摩尔比范围：3.3:2.5:3.6。(3)GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器制备将IL-GR超声分散于明胶溶液中制备IL-GR-Gel分散液。玻碳电极(GCE)抛光后用丙酮、无水乙醇依次超声洗涤后晾干。将IL-GR-Gel分散液与乙酰胆碱酯酶(AChE)溶液(V/V，2-3:1)混合后滴加在处理过的玻碳电极表面，将其置于4-5℃冰箱中干燥。然后将电极浸入戊二醛(GA)溶液中交联，即得GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器。IL-GR与明胶重量比：2:5。测试方法采用差分脉冲伏安法(DPV)检测有机磷农药。对含1.0mmol/L氯化乙酰胆碱(ATCl)的0.1mol/L(pH7.0)的PBS溶液进行DPV扫描，确定传感器的原始响应电流(I0)。然后将其置于不同浓度的农药溶液中浸泡5min，相同条件下测定传感器在ATCl中的响应电流(I1)。根据前后电流的变化计算抑制率(I％)，根据I％与有机磷农药浓度的对数关系建立工作曲线。抑制率计算公式如下：I％＝[(I0－I1)/I0]×100％实际样品的检测购买的实际样品处理后，取一定量样品喷洒不同浓度的有机磷农药。将每个样品用丙酮浸泡，4-5℃过夜并过滤，残余物用丙酮洗涤，并将洗涤液与滤液合并定容至容量瓶中制备样品溶液。先测定传感器在含1.0mmol/LATCl的0.1mol/L(pH7.0)的PBS溶液中的原始响应电流(I0)，再测定在上述溶液中加入一定量的样品后传感器的响应电流，根据上述公式计算抑制率(I％)。样品中农药的浓度根据其抑制率，通过获得的标准曲线求得。本专利技术的测定原理如下：加入到电解池的底物氯化乙酰胆碱受固定在电极表面的乙酰胆碱脂酶催化水解，形成胆碱和乙酸。胆碱在相应电位下氧化产生氧化电流。加入有机磷后，乙酰胆碱脂酶的催化活性降低，水解反应受到抑制，减少了反应产物，导致胆碱氧化电流的减小，而氧化电流的减少量能准确的反映出乙酰胆碱脂酶被抑制的程度，根据前后电流的变化计算抑制率(I％)，根据I％与有机磷农药浓度的关系建立的标准工作曲线，从而检测出有机磷的浓度。本专利技术创新点在于：利用离子液体功能化石墨烯和明胶的优良特性，将离子液体功能化石墨烯(IL-GR)用于乙酰胆碱酯酶(AChE)的固定，利用明胶可为酶固定提供自然的微环境，良好的生物相容性和成膜能力，制备了新型复合膜IL-GR-Gel修饰的乙酰胆碱酯酶生物传感器。实现了有机磷农药的高灵敏检测。该方法克服了现有的有机磷测定方法速度慢，成本高，操作繁琐的缺点，提供了一种简单，快速，灵敏度高的有机磷农药测定方法。本专利技术优点在于：一、不需要样品的预处理，节约了时间；二、使用价格相对低廉的离子液体功能化石墨烯和明胶固定乙酰胆碱酯酶构制新型传感器，节约了成本；三、检测结果的灵敏度很高，最低检测浓度为5.0×10-14mol/L。可用于低含量样品的检测。四、乙酰胆碱酯酶负载量高，达0.25U。附图说明图1为本专利技术AChE生物传感器构制原理图。图2为本专利技术AChE生物传感器对氯化乙酰胆碱抑制率与有机磷农药浓度的对数关系建立的工作曲线图。具体实施方式下面结合实例对本专利技术做详细说明，并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。实施例11、材料与试剂CHI-660E电化学工作站上海辰华仪器有限公司氯化乙酰胆碱(ATCl)，乙酰胆碱酯酶(AChE，C3389，236U/mg)和戊二醛(GA，25％)，Sigma–Aldrich(St.Louis，USA)生产久效磷(97.4％)北京上立方联合化工技术研究院生产化学试剂：均为分析纯2、试剂的配制：2.10.1mol/L的磷酸盐(PBS)缓冲液：由0.1mol/L磷酸二氢钠和0.1mol/L磷酸氢二钠按照一定的体积比混合而成。2.21.0×10-2mol/L氯化乙酰胆碱溶液：0.1817克氯化乙酰胆碱使用0.1mol/LPBS(pH＝7.5)定容至100ml容量瓶。2.3乙酰胆碱酯酶溶液：购买的纯品使用0.1mol/LPBS(pH＝7.5)溶液稀释使用。2.41.0×10-3mol/L久效磷溶液：0.02232克久效磷用少量丙酮溶解后，蒸馏水定容在100ml容量瓶。3、制备方法(1)氨基功能化离子液体1-(3-氨基丙基)-3-甲基咪唑四氟硼酸盐(IL-NH2)的合成25mL圆底烧瓶中加入1g3-溴丙胺氢溴酸盐和0.36mLN-甲基咪唑，再加入10mL无水乙醇作为溶剂，充分溶解之后加氮气保护，在油浴锅中缓慢升温至80℃，回流反应24h。反应结束后，45℃旋蒸除去溶剂，瓶底的淡黄色油状物即为粗产品，加入适量乙醚超声洗涤3次，倾去乙醚，将淡黄色油状物用适量水溶解，加入本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于有机磷农药检测的乙酰胆碱酯酶生物传感器，其特征在于，通过以下方法制备而成：（1）氨基功能化离子液体1‑（3‑氨基丙基）‑3‑甲基咪唑四氟硼酸盐（IL‑NH

【技术特征摘要】
1.用于有机磷农药检测的乙酰胆碱酯酶生物传感器，其特征在于，通过以下方法制备而成：（1）氨基功能化离子液体1-（3-氨基丙基）-3-甲基咪唑四氟硼酸盐（IL-NH2）的合成3-溴丙胺氢溴酸盐和N-甲基咪唑混合，以无水乙醇作为溶剂，氮气保护，回流反应，旋蒸除去溶剂，乙醚超声洗涤，调节pH值在8-9，旋蒸除去水制得1-（3-氨基丙基）-3-甲基咪唑溴盐，然后和四氟硼酸钠发生离子交换制得1-（3-氨基丙基）-3-甲基咪唑四氟硼酸盐；3-溴丙胺氢溴酸盐和N-甲基咪唑摩尔比：1:1；(2)离子液体功能化石墨烯（IL-GR）的合成石墨粉缓缓地加入浓硫酸中，搅拌反应，冰水浴条件下，搅拌状态下慢慢加入KMnO4，控制温度在35-40℃，恒温反应；反应后将其加入蒸馏水中，搅拌下加入H2O2，反应结束后，洗涤产物，干燥，得到石墨烯氧化物（GO）；将GO、1-（3-氨基丙基）-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和KOH混合，80-90℃搅拌反应，尔后加入NaBH4溶液得到离子液体功能化石墨烯（IL-GR）；石墨粉、浓硫酸、KMnO4、H2O2摩尔比：4:18:1.2:4；GO、1-（3-氨基丙基）-3-甲基咪唑四氟硼酸盐和KOH的摩尔比：3.3:2.5:3.6；(3)GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器制备将IL-GR超声分散于明胶溶液中制备IL-GR-Gel分散液；玻碳电极（GCE）抛光后用丙酮、无水乙醇依次超声洗涤后晾干；将IL-GR-Gel分散液与乙酰胆碱酯酶（AChE）溶液以2-3:1体积比混合后滴加在处理过的玻碳电极表面，将其置于4-5℃冰箱中干燥；然后将电极浸入戊二醛（GA）溶液中交联，即得GA/AChE-IL-GR-Gel/GCE生物传感器；IL-GR与明胶重量比范围：2:5。2.制备如...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘志敏，胡乐乾，李银峰，张红霞，
申请(专利权)人：河南工业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41