一种双特异纳米抗体，其包含：（a）与人CEA特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗人CEA VHH，以及（b）与人CD16特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含抗人CD16 VHH。该抗体分子能在原核表达系统中可溶性表达，有利于后续的分离纯化，并且具有较好的热稳定性和高度可溶性。此外，本发明专利技术使用的抗体片段为来自骆驼重链抗体的可变区序列，与抗原具有高结合亲和性，同时与人免疫球蛋白的重链可变区序列具有较高的同源性，抗原性弱。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及双特异抗体药物，特别涉及抗人肿瘤相关抗原CEA和抗人自然杀伤细胞的特异性抗原CD16的双特异抗体药物。
技术介绍
肿瘤免疫治疗中，双特异抗体（bispecificantibody,bsAb）在其中起到了非常重要的作用。双特异抗体是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，通过结合位点，可同时结合效应细胞与靶细胞表面的特异性抗原，激活静止状态的效应细胞并募集到靶细胞周围，介导靶细胞的凋亡或裂解。已开发出多种靶向不同免疫效应细胞和肿瘤细胞的bsAb，其中在肿瘤免疫治疗中的主要免疫效应细胞为T细胞、NK细胞和巨噬细胞等。NK细胞和T细胞是目前研究较多的效应细胞。在T细胞表面具有引发作用的分子，包括CD2、CD3、CD28等，因此在构建用于肿瘤治疗的双特异抗体时，通常都包括识别这些分子的特异性，其中基于CD3和CD28的双特异抗体研究较多。BiTE（（bispecificTcellengager，双特异T细胞募集者）是一种双特异抗体的形式，能通过抗CD3的单链抗体片段最大程度的介导T细胞靠近肿瘤细胞，进而发挥裂解肿瘤的作用。当前，有几种靶向BiTE正在研发之中，比如CD19（针对B细胞癌）、上皮细胞粘附分子（EpCAM，CD326），前列腺特异膜抗原（PSMA），以及CEA。自然杀伤细胞（naturalkillercell,NK）是体内免疫中的重要组成部分，在天然免疫中识别外界抗原，进而直接清除。其杀伤作用具有MHC非限制性，多种肿瘤细胞对NK细胞介导的杀伤作用敏感。其表面特异性分子CD16，是一种分布于NK细胞，中性粒细胞和单核细胞、巨噬细胞等表面的低亲和力Fc受体。CD16通过结合IgG的Fc区域，可以激活NK细胞产生抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity,ADCC）。bsAb分子上的抗CD16抗体结合位点，可以在两个方面增加NK细胞基础上的免疫治疗作用，1.作为肿瘤部位的锚定分子，募集NK细胞，使得局部NK细胞数量增加，延长肿瘤细胞与NK的接触时间，增强NK细胞的杀伤作用，2.在肿瘤部位激活NK细胞，进而杀伤肿瘤细胞。目前已有多种结合CD16与肿瘤相关抗原的双特异抗体在研究之中，比如靶向Her2、CD33、CD20等。其中靶向CD30和CD16的双特异抗体AFM13，用于治疗顽固性和/或再发性霍奇金淋巴瘤已经进入临床试验（clinicaltrials.govidentifier:NCT01221571）。CEA是一种分子量约180-200kd的高度糖基化的癌胚蛋白，参与细胞粘附，在正常的胎儿胃肠组织表达。也存在于95%的结肠癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞表面。目前，常作为一种广泛使用的肿瘤相关抗原，其血清CEA水平被用于疾病发生发展、监测和某些肿瘤的预后指标。同时，肿瘤CEA在免疫诊断和免疫治疗上也是一种很有用的靶标。FDA已经同意了几个放射标记的抗CEA抗体或抗体片段用于体内影像，比如由Immunomedics公司开发的99mTc标记的CEA抗体Artitumomab。MEDI-565，又名MT111或AMG211，是一种BiTE抗体，能介导T细胞杀伤表达CEA的肿瘤细胞，且与肿瘤细胞系的突变状态无关。现在该药物正处于临床I期实验（ClinicalTrails.gov,NCT02291614）中，用于治疗晚期结肠腺癌。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种抗CEA-CD16的双特异抗体，其能够特异性地与这两者结合，引导NK细胞靠近CEA表达阳性细胞，进而通过ADCC效应，杀伤或抑制肿瘤的生长。为实现上述目的，本专利技术的一个方面提供一种双特异纳米抗体，其包含：（a）与人CEA特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗人CEAVHH，以及（b）与人CD16特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含抗人CD16VHH。在一个实施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的N末端。在另一个实施方式中，所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的C末端。在一个实施方式中，所述抗人CEAVHH的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。在另一个实施方式中，所述抗人CD16VHH的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示在一个实施方式中，所述第一结合结构域通过连接肽与所述第二结合结构域连接。在优选的实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。本专利技术的另一个方面提供一种治疗患有CEA阳性表达肿瘤的患者的药物组合物，所述药物组合物包含所述双特异纳米抗体以及药用辅料。在另一个实施方式中，所述药物组合物包含所述双特异纳米抗体以及第二种抗癌剂。在一个实施方式中，所述CEA阳性表达肿瘤为结直肠癌、胰腺癌、食道癌、胃腺癌、乳腺癌或肺癌。在另一个实施方式中，所述肿瘤为进行性肿瘤、晚期肿瘤、或迁移肿瘤。在另一个实施方式中，所述患者具有超过100ng/ml的CEA血清浓度。本专利技术的另一个方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含核酸序列，所述核酸序列编码本专利技术所述的双特异纳米抗体。本专利技术的另一个方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含载体，所述载体包含上述核酸序列。本专利技术的另一个方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含宿主，所述宿主使用上述核酸序列或载体转化或转染。本专利技术运用基因工程等技术手段，将识别CD16和识别CEA的纳米抗体片段构建在同一抗体分子中，能够特异性地与这两者结合，引导NK细胞靠近CEA表达阳性细胞，进而通过ADCC效应，杀伤或抑制肿瘤的生长。该抗体分子能在原核表达系统中可溶性表达，有利于后续的分离纯化，并且具有较好的热稳定性和高度可溶性。此外，本专利技术使用的抗体片段为来自骆驼重链抗体的可变区序列，与抗原具有高结合亲和性，同时与人免疫球蛋白的重链可变区序列具有较高的同源性，抗原性弱。附图说明图1示意性地显示本专利技术双特异抗体的一个实施方式的结构示意图。（A）结构域示意图；（B）模块化示意图。图2显示本专利技术的双特异抗体的表达与纯化过程中的电泳图。（A）Ni-NTA纯化过程分析电泳图；（B）Q-sepharoseHP纯化的SDS-PAGE电泳分析图。图3显示流式细胞术分析双特异抗体与CEA的结合。图4显示WesternBlot分析双特异抗体对CEA的结合，其中Lane1：HT29，Lane2：LS174T，Lane3：SKOV3，Lane4：SKOV3/CEA。图5显示体外细胞毒性试验的结果。图6显示体外EC50实验的结果，其中HT29的EC50值为0.16nM，LS174T的EC50值为0.01nM。结果代表至少3次试验的平均值。图7为CEA表达阴性细胞系SKOV3的anti-CEAVHH（A）及anti-CD16VHH（B）对双特异抗体介导的细胞毒性干扰试验结果。图8为CEA表达阳性细胞系LS174T的anti-CEAVHH（A）及anti-CD16VHH（B）对双特异抗体介导的细胞毒性干扰试验结果。图9为可溶性CEA对双特异抗体介导的细胞毒性干扰（LS174T）试验结果。图10显示双特异抗体对人结肠癌LS174NOD/SCID小鼠移植瘤生长的抑制作用。具体实施方式纳米抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双特异纳米抗体，其包含：（a）与人CEA特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗人CEA VHH，以及（b）与人CD16特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含抗人CD16 VHH。
【技术特征摘要】
1.一种双特异纳米抗体，其包含：（a）与人CEA特异性结合的第一结合结构域，所述第一结合结构域包含抗人CEAVHH，以及（b）与人CD16特异性结合的第二结合结构域，所述第二结合结构域包含抗人CD16VHH。2.根据权利要求1所述的双特异纳米抗体，其中所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的N末端。3.根据权利要求1所述的双特异纳米抗体，其中所述抗人CEAVHH位于所述抗人CD16VHH的C末端。4.根据权利要求1所述的双特异纳米抗体，其中所述抗人CEAVHH的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示。5.根据权利要求1所述的双特异纳米抗体，其中所述抗人CD16VHH的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。6.根据权利要求1所述的双特异纳米抗体，其中所述第一结合结构域通过连接肽与所述第二结合结构域连接。7.根据权利要求6所述的双特异纳米抗体，其中所述连接肽的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示。8.一种治疗患有CEA阳...
【专利技术属性】
技术研发人员：王忠，李庆，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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