本发明专利技术公开了一种具有抗肿瘤活性的核桃多肽纳米硒的制备方法，该方法包括以下步骤：（1）核桃粕限制性酶解；（2）浓缩、喷雾干燥，得到核桃多肽；（3）在核桃多肽溶液中加入无机硒源和维生素C制备功能化纳米硒溶胶；（4）将溶胶进行透析；（5）冷冻干燥，得核桃多肽纳米硒。产品溶解为橙红色溶胶，扫描电镜观察多肽纳米硒形貌，可观察到粒径均匀的纳米球。本发明专利技术所研制的核桃多肽纳米硒，可用于补硒剂保健品及药品的制备，且通过细胞实验证明该溶胶具有明显的抗肿瘤生理活性，有望成为治疗癌症尤其是乳腺癌的高效低毒药剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种核桃多肽纳米硒的制备方法，具体涉及一种具有抗肿瘤活性的核桃多肽纳米硒的制备方法。
技术介绍
硒是生物体内必需的也不可缺少的营养元素之一，其最主要的生物学功能是构成谷胱甘肽过氧化氢酶（GSH-Px），催化还原型谷胱甘肽（GSH）变成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化物变为无毒的羟基化物（ROH）。在GSH-Px分子中发生氧化还原反应的唯一原子是硒，ROOH与H2O2在GSH-Px的催化下被分解，从而保护了细胞及其组织不被过氧化物损伤，特别是保护细胞和细胞器的膜，如线粒体、微粒体、溶酶体的膜。硒及其化合物在抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等方面发挥重要作用。硒摄入量不足会增加癌症发生的机率。 硒的活性依赖于硒的化学形态和吸收剂量，无机硒和大部分有机硒化合物毒性都比较强，而且硒的营养剂量和毒性剂量之间范围特别狭窄，难以控制精确的使用剂量，容易造成机体硒中毒。因此，寻找新型硒形态并研究其抗肿瘤活性及其作用机制是当今化学、生物、医学、纳米技术等相关交叉学科的研究热点。 纳米单质硒属于无机硒，具有活性高、毒性低的特点，在肿瘤预防、治疗、降低化疗抗药性和化疗辅助增敏等方面显示出极大的优势。单质硒粒度一旦达到纳米尺度，在水相中就形成胶体，其稳定性好，除了具有硒元素所具备的生物活性，又具有纳米尺度效应。因此，纳米硒具有优于硒化合物的性能。 用多肽来制备纳米药物的载体具有很好的生物兼容性，多肽具有耗能低、转运速度快和不易被饱和的特点，此外多肽还具有很好的营养作用：提高氨基酸的利用率，促进蛋白质的合成和矿质元素的吸收等。将多肽与硒化合，通过调控所形成纳米粒子的粒径、改变其表面结构或带电性等，提高纳米粒子的水溶性、生物兼容性或者生物之间的识别能力。 核桃粕是核桃榨油后的副产物，含有40%以上的蛋白质。核桃蛋白是一种优质的植物蛋白，含有18种氨基酸，且人体所需的8种必需氨基酸含量合理。但目前大部分优质核桃粕直接当作饲料和肥料处理掉，浪费了许多优质蛋白质资源。本专利采用限制性酶法改性技术对核桃粕进行深加工制备核桃多肽，并调控其与亚硒酸钠作用，制备纳米硒。核桃多肽纳米硒具有很高的抗肿瘤活性，在用于补硒剂保健品及药品的制备的同时，有望成为治疗癌症的高效低毒药剂。。 有关多肽调控制备功能化纳米硒的研究目前尚无。目前公开的中国专利中与多肽-硒合剂相关的专利共有3个： （1）公开号CN 102552739 A公开了“抗肿瘤抗氧化抗缺氧的含硒肽合剂及其制备方法”，（2）公开号CN 102772696 A公开了“硒环肽·脂肪酸合剂及其制备方法”，这两个专利的专利技术人都是北京港生药业科技有限公司的杨吉星和杨京润，都是以中药和硒为基原，利用微生物发酵技术制备的螯合物。（3）公开号CN 102302507 A公开了“定向控释微量元素的药物组合物及制备方法和应用”，该专利涉及微量元素与多肽、蛋白或其它化合物形成离子复合物，再用复合膜材料制备空心微球包裹该复合物。 综上所述，目前关于核桃多肽调控制备具有抗肿瘤活性的纳米硒的报道尚无。本专利技术人以核桃粕为原料，限制性酶解法制备核桃蛋白活性多肽，用核桃多肽制备具有抗肿瘤活性的功能化纳米硒。该法制得的产品安全性高，方法简便可大量生产，在作为补硒剂的同时还具有极高的抗肿瘤活性，可发展成为治疗癌症尤其是乳腺癌的高效低毒药剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过核桃多肽调控制备具有抗肿瘤活性的功能化纳米硒，为相关抗癌药物的开发提供一种具有抗肿瘤活性的核桃多肽纳米硒的制备方法。 一种具有抗肿瘤活性的核桃多肽纳米硒的制备方法，包括如下步骤： （1）限制性酶解：将核桃粕与水混合，加入占核桃粕蛋白质量 2.0%~3.0 %的蛋白酶，在48~55℃酶解30-35 h；沸水中10~30 min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃多肽液； （2）浓缩、喷雾干燥：将核桃粕蛋白酶解液于55~65℃真空旋转蒸发，浓缩后的产物经喷雾干燥制得核桃多肽粉末； （3）在无机硒源和维生素C溶液中加入核桃多肽制备功能性纳米硒溶胶：配制 8-10 mmol/l 的维生素C溶液和 0.3-0.6 mmol/l 的亚硒酸钠溶液，加入核桃多肽粉末，混合后反应，得到溶胶； （4）将溶胶进行透析：用透析袋于 4-10 ℃对溶胶进行透析； （5）冷冻干燥，得核桃多肽纳米硒：对透析后的溶胶进行冷冻干燥，得到核桃多肽纳米硒。 上述方法中，步骤（1）中，所述核桃粕蛋白质含量为 40~45 w/w %。 上述方法中，步骤（1）中核桃粕与水的质量比为 1 : 4~ 1 :6；所采用的蛋白酶为中性蛋白酶；所得核桃粕蛋白酶解液的蛋白质回收率为45%~ 50%。 上述方法中，步骤（2）所述核桃粕蛋白酶解液浓缩至固形物 20~ 25 Brix 后喷雾干燥，所得粉末颗粒细度均一。 上述方法中，步骤（3）中核桃多肽在最终维生素C溶液及亚硒酸钠的混合溶液中的质量百分比浓度为30%~ 35%，所述反应具体条件为：在35 ~ 40℃下恒温震荡反应10~15 h。 上述方法中，步骤（4）所述透析袋的截留分子量为 100 ~500 Da、透析时间为12 - 18 h。 上述方法中，步骤（5）所述冷冻干燥时间为36- 40 h。 本专利技术所得核桃多肽纳米硒通过扫描电镜可观察到粒径均匀的纳米球，是通过MTT法检测肿瘤细胞存活率及用偏光显微镜和扫描电镜观察处理前后的肿瘤细胞形态等综合指标，证明本专利技术产品具有抗肿瘤的性能。 本专利技术具有如下优点： 1、本专利技术公布的具有抗肿瘤活性的核桃多肽纳米硒制备工艺中利用透析去除未被还原的硒离子，且MTT法检测结果显示与单一核桃多肽相比，核桃多肽纳米硒具有显著抑制肿瘤细胞增殖的能力，表明该核桃多肽纳米硒的抗肿瘤活性并非来自单一多肽成分，而是通过调控多肽与硒合成的纳米硒才具备的独特活性。 2、本专利技术公布的抗肿瘤活性核桃多肽纳米硒能明显抑制肝癌细胞HepG2、乳腺癌肿瘤细胞MCF-7、胃癌细胞SCG-7901、肺癌细胞A549、前列腺癌细胞PC3以及子宫颈癌细胞Hela的增殖，其中对MCF-7细胞的抑制作用最为明显。 3、本专利技术公布的抗肿瘤活性核桃多肽纳米硒制备工艺简单，产品安全，可规模化生产。 4、 通过扫描电镜观察多肽纳米硒形貌，细胞试验证实其抗肿瘤效果显著。 附图说明 图1为核桃多肽和核桃多肽纳米硒分别对正常细胞和不同肿瘤细胞增殖的抑制作用效果图； 图2a-图2d为偏光显微镜观察不同浓度的核桃多肽纳米硒对乳腺癌肿瘤细胞MCF-7的损伤情况图，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有抗肿瘤活性的核桃多肽纳米硒的制备方法，其特征在于包括如下步骤： （1）限制性酶解：将核桃粕与水混合，加入占核桃粕蛋白质量 2.0%~3.0 %的蛋白酶，在48~55℃酶解30‑35 h；沸水中10~30 min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃多肽液；（2）浓缩、喷雾干燥：将核桃粕蛋白酶解液于55~65℃真空旋转蒸发，浓缩后的产物经喷雾干燥制得核桃多肽粉末；（3）在无机硒源和维生素C溶液中加入核桃多肽制备功能性纳米硒溶胶：配制 8‑10 mmol/l 的维生素C溶液和 0.3‑0.6 mmol/l 的亚硒酸钠溶液，加入核桃多肽粉末，混合后反应，得到溶胶；（4）将溶胶进行透析：用透析袋于 4‑10 ℃对溶胶进行透析；（5）冷冻干燥，得核桃多肽纳米硒：对透析后的溶胶进行冷冻干燥，得到核桃多肽纳米硒。
【技术特征摘要】
1.一种具有抗肿瘤活性的核桃多肽纳米硒的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）限制性酶解：将核桃粕与水混合，加入占核桃粕蛋白质量 2.0%~3.0 %的蛋白酶，在48~55℃酶解30-35 h；沸水中10~30 min灭酶，离心，取上清液，抽滤，得到核桃多肽液；
（2）浓缩、喷雾干燥：将核桃粕蛋白酶解液于55~65℃真空旋转蒸发，浓缩后的产物经喷雾干燥制得核桃多肽粉末；
（3）在无机硒源和维生素C溶液中加入核桃多肽制备功能性纳米硒溶胶：配制 8-10 mmol/l 的维生素C溶液和 0.3-0.6 mmol/l 的亚硒酸钠溶液，加入核桃多肽粉末，混合后反应，得到溶胶；
（4）将溶胶进行透析：用透析袋于 4-10 ℃对溶胶进行透析；
（5）冷冻干燥，得核桃多肽纳米硒：对透析后的溶胶进行冷冻干燥，得到核桃多肽纳米硒。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）中，所述核桃...
【专利技术属性】
技术研发人员：任娇艳，张榕，廖文镇，林泽华，刘鹏，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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