一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用技术

一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用，属于酶工程技术领域。本发明专利技术公开了一株重组表达短乳杆菌酪氨酸脱羧酶TDC的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC，该基因工程菌的构建方法，高表达可溶性TDC的方法，及该酶的应用。将TDC编码基因连接表达载体并转入大肠杆菌表达宿主，通过在发酵培养基中添加葡萄糖显著提高了重组TDC（rTDC）的可溶性表达，蛋白产量达到224mg/L发酵液。采用Ni柱纯化C端带有His-Tag的rTDC，回收率90%。rTDC对于底物L-酪氨酸的比酶活为133.5U/mg。本发明专利技术的重组表达可溶性rTDC的方法具有表达水平高、纯化简单、回收率高、成本低等优点，可用于制备酪胺、多巴胺以及帕金森病的治疗研究。

【技术实现步骤摘要】
一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用
一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用，属于酶工程
本专利技术具体涉及短乳杆菌酪氨酸脱羧酶（TDC）基因的克隆、其基因工程菌的构建、重组TDC的高水平可溶性表达方法及该酶的应用。
技术介绍
酪氨酸脱羧酶（TDC）是一种磷酸吡哆醛（PLP）依赖型的脱羧酶，可催化酪氨酸脱羧生成酪胺。TDC普遍存在于微生物及植物体内，根据目前的研究，微生物来源TDC的比酶活比植物来源的TDC高几个数量级。同时，一些TDC具有多巴脱羧酶（DDC）活性，可将多巴脱羧生成多巴胺，因此TDC的研究对帕金森病的治疗具有参考价值。酪胺是许多神经激素的医药前体，如章鱼胺、大麦芽碱、辛弗林、肾上腺素、红景天苷等。目前酪胺的制备以化学合成法为主，但是存在能耗高、污染大、转化率低、回收率困难等问题。而生物法制备酪胺则由于TDC的来源有限而受到限制。多巴胺对帕金森病有显著的治疗效果。刘军等通过对帕金森病模型大鼠的研究发现，通过补充外源性的DDC保持脱羧酶活性，将内源性和外源性的L-多巴转化为多巴胺，对于改善帕金森病患者的症状、延缓和减低患者的症状波动具有积极的意义。目前的报道显示，短乳杆菌来源的TDC的DDC活性要比昆虫、动物的DDC高出1个数量级或以上。目前国内外对于TDC的研究发现，野生菌的产酶能力低下，且纯化步骤比较复杂，回收率普遍较低。Borresen等报道的粪链球菌来源的TDC纯化后比活力115U/mg，回收率3.4%；Moreno-Arribas等报道的短乳杆菌来源的TDC纯化后比活力1058U/mg，是目前酶活力最高的TDC，但回收率也只有24%。有关TDC重组表达的文献十分有限，几乎都没有提到重组表达后的表达量问题。从彭静叶对大红景天TDC的研究来看，重组表达后绝大多数都以包涵体的形式存在，通过包涵体复性实验，虽然恢复了部分活性，但步骤复杂，酶活回收率极低。范恩宇对谷氨酸脱羧酶（GAD）进行研究时发现：一段1881bp的GAD基因在异源表达时全部以包涵体的形式存在，对其进行发酵条件优化也未得到任何结果；该GAD基因与短乳杆菌的TDC基因的氨基酸序列同源性在99%以上。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组酪氨酸脱羧酶的可溶性高表达的方法及该酶的应用，解决如下技术问题：1、大肠杆菌重组表达短乳杆菌来源的TDC编码基因。2、解决rTDC在大肠杆菌中异源重组表达时大量包涵体的问题，实现其高水平可溶性表达。3、建立rTDC的纯化方法并提高其回收率。4、rTDC用于制备酪胺和多巴胺。5、rTDC作为外源性添加研究其对帕金森病的治疗效果。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：1．本专利技术的技术方案之一是：提供一株重组表达短乳杆菌酪氨酸脱羧酶TDC的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC，该基因工程菌携带TDC基因的重组表达载体pET24-TDC，所述的TDC基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2、本专利技术的技术方案之二是：所述的重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC的构建方法，包括如下步骤：（1）提取短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）CGMCC1.2028（见WORD附件CGMCC网页保藏说明）全基因组；（2）引物设计：PCR扩增的引物设计参照GenBank中编码TDC的基因序列（EU195891.1），上游引物：5’-ctagctagcatggaaaaaagtaatcgctcac-3’，如SEQIDNo.2所示，在5’端加上NheI酶切位点；下游引物：5’-ccgctcgagaacattttccttttgattaac-3’，如SEQIDNo.3所示，在5’端加上XhoI酶切位点；引物中未设计TDC基因末端的终止密码子，以便在重组TDC的C端融合6*His-Tag；（3）使用步骤（2）的引物，通过PCR扩增步骤（1）中短乳杆菌全基因组的TDC基因，连接pMD18-T克隆载体，重组质粒为pMD18-TDC，克隆宿主为大肠杆菌JM109；（4）将步骤（3）的TDC重组质粒进行双酶切，获得的TDC片段插入到pET-24a质粒中，得到重组质粒pET24-TDC，其克隆宿主为大肠杆菌JM109；（5）将步骤（4）得到的重组质粒pET24-TDC转入大肠杆菌BL21(DE3)，筛选阳性重组子，获得重组表达TDC的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC。3、本专利技术的技术方案之三是：重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC的培养和诱导方法，将该基因工程菌按体积比1%～10%接种LBG或TBG培养基中，当OD达到0.5时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在15~37℃条件下诱导2~10h，得发酵液备用；LBG培养基为含0.2%～2%葡萄糖的LB培养基；TBG培养基为含0.2%～2%葡萄糖的TB培养基。4、本专利技术的技术方案之四是：优化发酵培养基组成，提高rTDC的可溶性表达，并优化rTDC的诱导条件。（1）基因工程菌的摇瓶实验发酵培养基为LBG/Kan（含0.2%－2%葡萄糖的LB培养基，卡那霉素Kan浓度为50mg/L）培养基，在OD达到0.5左右时加入IPTG，在15~37℃条件下诱导，得发酵液备用。（2）基因工程菌的3L发酵罐实验，发酵培养基为TBG/Kan（含1%葡萄糖的TB培养基，Kan浓度为50mg/L）培养基，OD达到1.0~4.0时加入IPTG，在15~37℃条件下诱导，得发酵液备用。5、本专利技术的技术方案之五是：重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC的重组TDC蛋白纯化方法，将技术方案之三或四所得的发酵液离心，用缓冲液A将沉淀重悬，超声或高压匀浆破碎全细胞，离心获得的上清液为TDC粗酶液，用Ni柱进行亲和层析，获得TDC纯酶，并用凝胶柱层析去除咪唑；步骤为：（1）将诱导后的基因工程菌发酵液离心，获取全细胞并用缓冲液A（Tris-HCl25mM，pH7.4，咪唑20mM，氯化钠300mM）重悬，用超声破碎仪或高压匀浆机破碎，再次离心并保留上清液。（2）用缓冲液A（Tris-HCl25mM，pH7.4，咪唑20mM，氯化钠300mM）平衡Ni柱，然后将重组菌破碎后的上清液上样，上样后用缓冲液B（Tris-HCl25mM，pH7.4，咪唑280mM，氯化钠300mM）进行洗脱，获取rTDC酶液。（3）用缓冲液C（Tris-HCl25mM，pH7.4，氯化钠150mM）平衡凝胶柱，将Ni柱纯化得到的rTDC酶液上样，上样后继续用缓冲液C洗脱，获取rTDC纯酶液。6、本专利技术的技术方案之六是：用技术方案五所得的诱导后的基因工程菌全细胞或TDC酶液进行酪胺、多巴胺的制备；或用技术方案五所得的TDC纯酶进行治疗帕金森病的应用研究。测定rTDC的酶学性质及对L-酪氨酸的动力学参数，测定rTDC对L-多巴及其他芳香族氨基酸的脱羧活性，用于rTDC催化制备酪胺、多巴胺等。以下均使用凝胶柱纯化后的TDC纯酶液。（1）底物的消耗量及产物的生成量用高效液相色谱（HPLC）法检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株重组表达短乳杆菌酪氨酸脱羧酶TDC的基因工程菌E.?coli?BL21?(DE3)/pET24?TDC，其特征在于，该基因工程菌携带TDC基因的重组表达载体pET24?TDC，所述的TDC基因核苷酸序列如SEQ?ID?No.?1所示；表达载体为pET?24a，表达宿主为大肠杆菌E.?coli?BL21?(DE3)。

【技术特征摘要】
1.一种重组表达短乳杆菌TDC的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC的培养和诱导方法，其特征在于，优化发酵培养基组成，提高rTDC的可溶性表达，并优化rTDC的诱导条件，TDC基因核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，（1）基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET24-TDC的摇瓶实验，发酵培养基为LBG/Kan培养基：LBG培养基为含0.2%~2%葡萄糖的...

【专利技术属性】
技术研发人员：倪晔，章凯，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：